Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Resumo

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Resumo

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introdução

As mitocôndrias e no retículo endoplasmático (ER) não são independentes organelos na célula, mas eles interagem funcionalmente e estruturalmente em locais de contacto definidos como membranas do retículo endoplasmático associada-mitocôndrias (MAM). Na verdade, MAMs correspondem a regiões onde as membranas do ER e mitocôndrias são intimamente apostos, permitindo interacções entre proteínas a partir de ambos os lados. No entanto, as membranas das organelas estas não fundem dentro destas regiões, de modo que eles mantêm as suas entidades separadas. Os MAMs desempenhar um papel crucial em cálcio ^{(Ca2 +)} e de transferência de fosfolípidos de ER para a mitocôndria, afectando o metabolismo da energia e a sobrevivência de células ^3/1.

A associação entre o ER e mitocôndrias foi visualizado pela primeira vez na década de 1970 com microscopia eletrônica. Desde então, microscopia eletrônica de transmissão ^4,5, tomografia eletrônica de ^6,7 ou imuno-localização de ER e específicos de mitocôndrias fluoróforos / proteínas fluorescentes ⁸ foram classicamente utilizada para estudar interacções ER-mitocôndrias. Outra ferramenta útil para a análise de MAM baseia-se na utilização de fraccionamento subcelular. Ele permite o isolamento de fracções MAM por ultracentrifugação diferencial acoplado a um gradiente de Percoll ^9. No entanto, o produto final contém fracções enriquecidas MAM, em vez de fracções puras. No seu conjunto, estas estratégias não são particularmente sensíveis e / ou quantitativa, e eles não são facilmente adaptado a uma grande rastreio. Alternativamente, as abordagens genéticas utilizando ligantes fluorescentes inter-organelos drogas induzível emergiram, mas que não permitem a análise de interacções de organelos nos níveis de expressão de proteínas endógenas ^10.

Com base na descoberta de Szabadkai do complexo IP3R / Grp75 / VDAC no MAM ^11, foi desenvolvido um método quantitativo para analisar as interações ER-mitocôndrias. Utilizou-se o no ligati proximidade situem ensaio para detectar e quantificar interacções entre VDAC1 e IP3R1, duas proteínas de organelos de superfície envolvidas no Ca ²⁺ -channeling complexo na interface MAM em células fixas ^12. Resumidamente, nós sondadas VDAC1 na membrana mitocondrial externa (anticorpo primário anti-rato VDAC1) e IP3R1 na membrana ER (anticorpo primário anti-coelho IP3R1) (Figura 1, painel A). Em seguida, de acordo com o ensaio, foram adicionados tanto anti-ratinho e anti-IgG de coelho (sondas de ensaio do rato e coelho proximidade ligadura), o qual está conjugado com extensões de oligonucleótido complementar. Se as duas proteínas alvo estão a uma distância inferior a 40 nm, os oligonucleótidos podem hibridizar com os oligos conector posteriormente adicionada para permitir a formação de um modelo circular de ADN (Figura 1, painel b). Esta molécula de ADN circular é ligado e amplificado, criação de um produto de ADN de cadeia simples ligado covalentemente a um dos sensores de proximidade (Figura 1, painel C) . Uma vez que a distância entre o ER e mitocôndrias na interface MAM varia de 10 nm a 25 nm, ^6, a ligação de proximidade e de amplificação pode ser feita, conduzindo à subsequente detecção devido à hibridação da Texas oligonucleótidos vermelho-sondas marcadas (Figura 1, painel D ). Cada ponto representa fluorescente interacções entre VDAC1 / IP3R1, permitindo, assim, a quantificação da in situ interacções ER-mitocôndria em células individuais.

Figura 1: Esquema Ilustração da detecção das interações retículo endoplasmático-mitocôndrias por In Situ Proximidade Ligadura de Ensaio. a) um anticorpo de ratinho dirigido contra o primário VDAC1 e um anticorpo primário de coelho dirigido contra IP3R1 pode se ligarem aos seus epitopos em proximidade na interface MAM, b) A adição de um par de sondas de ligação de proximidadedirigido contra rato e IgG de coelho. Estas sondas têm anexado fitas de DNA que podem formar modelos para a ligação de oligos conector. c) A cadeia de ADN circular formado após a ligação pode ser amplificado e d) visualizadas por microscopia fluorescente como um ponto usando oligonucleótidos marcados Texas-red. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Semelhante em experiências de ensaio in situ de proximidade de ligação pode ser realizada com o par Grp75 / IP3R1 de anticorpos, bem como a ciclofilina D (CypD) / anticorpos IP3R1, considerando que CypD foi mostrado para interagir com o complexo IP3R / Grp75 / VDAC na interface MAM ^12-14.

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Protocolo

1. Preparação de Soluções

1. Prepare a 10% de formaldeído em PBS (sal baixo) por diluição de 5,5 ml de formaldeído a 37% em 14,5 ml de PBS. Prepare 1 M de glicina, pH 8,0, dissolvendo 3,8 g de glicina em 50 ml de PBS; diluir esta solução para se obter glicina 100 mM em PBS 1x.
2. Prepare 0,1% de Triton-X100 em PBS 1x. Prepare 20x Solução salina de citrato de sódio (SSC) utilizando 3,0 M de cloreto de sódio e citrato de trissódio 0,30 M preparada num tampão de água desionizada com pH 7,0 a 25 ° C. Diluir esse buffer para 1x e 0.01x usando água deionizada.

2. Fixação de Células

NOTA: Utilizou-se a linha celular de carcinoma hepatocelular Huh7 neste estudo, mas este método é aplicável a outras culturas de células aderentes.

1. células da placa HuH7 (cultivadas em DMEM, 1 g / L de glicose, suplementado com 10% de soro de vitelo fetal e penicilina-estreptomicina estoque 0,01%) a 150.000 células por placa com fundo de vidro não revestido de 35 mm. Ao trabalhar em células primáriasculturas, usar pratos revestidos com colagénio.
2. No dia seguinte, remover o meio de cultura. Lavam-se as células com 1 ml de PBS e aspirar. Fixar as células por adição de 1 ml de formaldeído a 10% e incubar durante 10 min à temperatura ambiente (TA), sob agitação.
3. Parar a reacção com 1 ml de 1 M de glicina e misturar por rotação. Remover a solução de reacção parada e lavar as células por adição de 1 ml de PBS 1x; Agitar, por rotação e aspirado. Adicionar 1 ml de glicina 100 mM para as células e incubar durante 15 min à TA com agitação, e, em seguida, aspirado.
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui e as etapas a seguir pode ser adiada para outro dia. Nesse caso, adicionar 1 ml de glicina 100 mM e manter a 4 ° C, se necessário.

3. A permeabilização de células

1. Adicionar 1 ml de 0,1% de Triton-X100 em PBS 1x, incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente sob agitação, e, em seguida, aspirado. Este tempo de incubação pode ser aumentada até 15 - 20 min quando se trabalha em cultur célula primáriaES (por exemplo, hepatócitos primários ratos). Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS 1x; aspirar.

4. Bloqueio

1. Adicionar 40 ul de solução para cada amostra (fornecida pelo kit) de bloqueio; este volume pode ser aumentado, a fim de cobrir a amostra. Incubar os pratos durante 30 min a 37 ° C numa câmara de humidade.
2. Toque na solução de bloqueio fora dos pratos. Tente obter volumes residuais iguais para cada slide, como isso vai afetar a reprodutibilidade. Não deixe que as amostras de secar!

5. Anticorpos Primários

1. Diluir os anticorpos primários em 1x PBS e adicionar a solução para os pratos (anticorpo de rato VDAC1: 1/100, anticorpo de coelho IP3R1: 1/500). Alternativamente, os anticorpos ou CypD Grp75 (ambos os anticorpos de ratinho utilizados em 1/500) pode ser usado em vez de VDAC1.
2. Incubar durante a noite numa câmara de humidade a 4 ° C. Lavar as lâminas duas vezes com tampão salino Tris com Tween (TBS-T) de 0,01%.

6. Proximidade Ligadura Ensaio Sondas

1. sondas de ensaio de proximidade de ligação são fornecidos pelo kit. Escolha sondas de acordo com as espécies de anticorpos primários.
2. Prepare os dois proximidade sondas de ensaio de ligação 1: 5 em diluente de anticorpo. Deixar a mistura em repouso durante 20 min à temperatura ambiente. Adicionar a solução de sonda de ensaio de proximidade de ligação diluída. Incubar os pratos em uma câmara de humidade pré-aquecida durante 1 hora a 37 ° C. Lavar os pratos duas vezes com TBS-T.

7. Ligadura

1. Utilizar o reagente de detecção in situ em Texas kit de vermelho.
2. Dilui-se a ligadura da 5x (fornecida pelo kit) 1: 5 em água de elevada pureza e misturar bem. Dilui-se a solução a ligase em 1x de ligação (fornecida pelo kit) 01:40 e vortex. Espera para adicionar a ligase até imediatamente antes da adição às amostras.
3. Adicionar esta solução para cada amostra (40 ul para pratos com fundo de vidro de 35 mm) e incubar os slides em uma cham humidade pré-aquecidoBER durante 30 min a 37 ° C. Lavar as lâminas duas vezes com TBS-T.

8. Amplification

Nota: Tenha cuidado, luz reagentes sensíveis.

1. Dilui-se a amplificação da 5x (fornecida pelo kit) 1: 5 em água de elevada pureza. Remover a polimerase a partir do congelador utilizando o bloco de congelação (-20 ° C). Dilui-se a polimerase (fornecida pelo kit) 1:80 em solução a amplificação 1x e vortex. Adicionar a polimerase imediatamente antes de utilizar a mistura.
2. Adicionar esta solução para cada amostra (40 ul para pratos com fundo de vidro de 35 mm). Incubar as lâminas numa câmara húmida pré-aquecida durante 100 minutos a 37 ° C. Toque a solução de amplificação da polimerase fora dos slides.

9. lavagem final

1. Lavar as lâminas em tampão de lavagem 1x SSC durante 2 minutos. Lavar as lâminas em tampão de lavagem SSC 0.01x por 2 min. Deixe os pratos secar à temperatura ambiente no escuro.

10. Preparação para criação de imagens

1. Montar as lâminas usando um volume mínimo de meio de montagem contendo DAPI (aquosa e não se solidifica), garantindo que não há bolhas de ar ficar preso sob a lamela. Nail polonês pode ser utilizado para vedar os bordos. Esperar por cerca de 15 min antes de analisar utilizando uma fluorescência ou microscópio confocal (excitação: 594 nm, emissão: 624 nm, a ampliação: 63X).
2. Após a imagiologia, armazenar as lâminas a -20 ° C no escuro.

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Resultados

Com base em nossa experiência de utilização deste protocolo, podemos seguramente recomendar este método para a visualização e quantificação das interações ER-mitocôndrias nas células fixas. Imagens representativas de interacções in situ em proximidade de ligação de ensaio visualizado-ER-mitocôndrias na linha celular de carcinoma hepatocelular Huh7, utilizando vários pares de anticorpos, são mostradas. Como mostrado na Figura 2 por microscopia ...

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Discussão

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35 mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10x	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1x
Tween 100x	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html