Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Zusammenfassung

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Einleitung

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) nicht unabhängig sind Organellen in der Zelle, aber sie interagieren strukturell und funktionell an Kontaktstellen definiert als Mitochondrien-assoziierte endoplasmatischen Retikulum Membranen (MAM). Tatsächlich entsprechen MAMs zu Regionen, in denen die Membranen des ER und Mitochondrien eng angelagert werden, so dass Wechselwirkungen zwischen Proteinen von beiden Seiten. Dennoch verschmelzen die Membranen dieser Organellen nicht innerhalb dieser Regionen, so behalten sie ihre separate Einheiten. Die MAMs spielen eine entscheidende Rolle bei der Calcium (Ca ²⁺⁾ und Phospholipid Transfer von ER zu den Mitochondrien, den Energiestoffwechsel und das Überleben der Zellen ^1-3 zu beeinträchtigen.

Die Assoziation zwischen dem ER und Mitochondrien wurde zuerst in den 1970er Jahren mit der Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Seitdem Transmissionselektronenmikroskopie ^4,5, Elektronentomographie ^6,7 oder Immuno-Lokalisierung von ER und Mitochondrien-spezifischen Fluorophores / fluoreszierende Proteine ⁸ wurden klassisch zu studieren ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen. Ein weiteres nützliches Werkzeug für die Analyse von MAM auf der Verwendung von subzellulären Fraktionierung basiert. Es erlaubt die Isolierung von MAM Fraktionen durch Differential Ultrazentrifugation gekoppelt mit einem Percollgradienten ^9. Allerdings enthält das Endprodukt angereichert MAM Fraktionen, anstatt reinen Fraktionen. Insgesamt sind diese Strategien nicht besonders empfindlich und / oder quantitative, und sie sind nicht leicht zugänglich für große Screening. Alternativ haben genetische Ansätze unter Verwendung von arzneimittel induzierbaren fluoreszierendes inter-Organell Linkern entstanden, aber sie haben nicht die Analyse von Organell Wechselwirkungen an den endogenen Expressionsniveaus von ¹⁰ Proteinen ermöglichen.

Basierend auf Szabadkai Entdeckung des IP3R / Grp75 / VDAC Komplex im MAM ¹¹ entwickelten wir eine quantitative Methode ER-Mitochondrien - Interaktionen zu analysieren. Wir haben die in situ Nähe ligatiauf Assay Wechselwirkungen zwischen VDAC1 und IP3R1 zwei Organell-Oberflächenproteine im Ca ²⁺ -channeling Komplex an der Grenzfläche MAM in fixierten Zellen ¹² beteiligt zu detektieren und zu quantifizieren. Kurz gesagt, sondiert wir VDAC1 an der äußeren mitochondrialen Membran (Maus - anti-VDAC1 primärer Antikörper) und IP3R1 an der ER - Membran (Kaninchen - anti-IP3R1 primärer Antikörper) (Abbildung 1, Tafel A). Dann wird gemäß dem Test haben wir sowohl anti-Maus- und anti-Kaninchen-IgG (Maus und Kaninchen Proximity Ligation Assay-Sonden), die an komplementäre Oligonukleotid Erweiterungen konjugiert sind. Wenn die beiden Proteine gezielt in einem Abstand von weniger als 40 nm sind, können die Oligonukleotide mit den anschließend zugegeben Verbinder Oligos hybridisieren die Bildung einer kreisförmigen DNA - Templat (1, Feld B) zu ermöglichen. Diese kreisförmige DNA - Molekül ligiert und amplifiziert, eine einzelsträngige DNA - Produkt kovalent an einer der Näherungssensoren zu schaffen (Abbildung 1, Tafel c) . Da der Abstand zwischen dem ER und Mitochondrien im MAM - Schnittstelle im Bereich von 10 nm bis 25 nm ^6, Proximity Ligation und Amplifikation kann durchgeführt werden, aufgrund der Hybridisierung von Texasrot-markierten Oligonukleotidsonden zum anschließenden Nachweis führen (Abbildung 1, Tafel d ). Jeder fluoreszierenden Punkt repräsentiert Wechselwirkungen zwischen VDAC1 / IP3R1, so dass die Quantifizierung der in - situ - ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in einzelnen Zellen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Detektion von endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien Wechselwirkungen von In Situ Proximity Ligation Assay. a) Antikörpers Eine Maus primären gegen VDAC1 und ein Kaninchen primären Antikörper gerichtet gegen IP3R1 an ihre Epitope in der Nähe an der Schnittstelle MAM binden kann, b) die Zugabe eines Paares von Annäherungs Ligierung Sondengegen Maus und Kaninchen-IgG. Diese Sonden wurden DNA-Stränge befestigt, die Vorlagen für die Unterbindung des Steckers Oligos bilden können. c) Die kreisförmige DNA - Strang nach Ligatur gebildet wird, kann verstärkt und d) durch Mikroskopie als fluoreszierender Punkt unter Verwendung Texas rot-markierten Oligonukleotiden sichtbar gemacht werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ähnliche in situ Proximity Ligation Assay Experimente können mit dem Grp75 / IP3R1 Paar von Antikörpern sowie Cyclophilin D (CypD) / IP3R1 Antikörper durchgeführt werden, wenn man bedenkt , dass CypD wurde an der MAM Schnittstelle mit dem IP3R / Grp75 / VDAC - Komplex interagieren gezeigt ^14.12.

Protokoll

1. Herstellung der Lösungen

1. Herstellung von 10% Formaldehyd in PBS (low-Salz) von 5,5 ml 37% Formaldehyd in 14,5 ml PBS verdünnt. Vorbereitung 1 M Glycin, pH 8,0, die durch Auflösen von 3,8 g Glycin in 50 ml PBS; verdünnt diese Lösung 100 mM Glycin in 1x PBS zu erhalten.
2. Bereiten 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Bereiten Sie 20x Saline Sodium Citrate (SSC) unter Verwendung von 3,0 M Natriumchlorid und 0,30 M Trinatriumcitrat in einem VE-Wasser-Puffer mit pH 7,0 bei 25 ° C. Verdünnen Sie diesen Puffer auf 1x und 0,01x entsalztes Wasser.

2. Fixierung von Zellen

HINWEIS: Es wird verwendet , um die HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie in dieser Studie, aber dieses Verfahren ist anwendbar auf andere adhärente Zellkulturen.

1. Platte HuH7 Zellen (kultiviert in DMEM 1 g / l Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 0,01% Penicillin-Streptomycin Lager) bei 150000 Zellen pro unbeschichteten 35-mm Glasbodenschale. Bei Arbeiten an PrimärzelleKulturen, verwenden Kollagen-beschichteten Schalen.
2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und absaugen. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Formaldehyd 10% und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren.
3. Stoppen Sie die Reaktion mit 1 ml 1 M Glycin und mischen durch Rotation. Entfernen Sie die Stopp-Reaktionslösung und die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; durch Rotation und absaugen agitieren. 1 ml 100 mM Glycin zu den Zellen und inkubiere sie für 15 min bei RT unter Rühren und dann absaugen.
   HINWEIS: Das Protokoll hier angehalten werden kann und die folgenden Schritte können auf einen anderen Tag verschoben werden. In diesem Fall 1 ml 100 mM Glycin und halten bei 4 ° C, falls erforderlich.

3. Die Permeabilisierung der Zellen

1. 1 ml 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, Inkubation für 15 min bei RT unter Rühren, und dann gründlich absaugen. Diese Inkubationszeit erhöht 15 werden konnte - 20 min, wenn sie auf Primärzelle cultur Arbeitses (zB primäre Mäuse Hepatozyten). Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; aspirieren.

4. Sperren

1. Werden 40 & mgr; l Blockierungslösung zu jeder Probe (vom kit); Dieses Volumen kann erhöht werden, um die Probe zu bedecken. Inkubiere das Geschirr für 30 min bei 37 ° C in einer Feuchtigkeitskammer.
2. Tippen Sie auf die Blockierungslösung aus der Gerichte. Versuchen Sie, gleich Restvolumina für jede Folie zu erhalten, da diese Reproduzierbarkeit beeinflussen. Lassen Sie sich nicht die Proben trocknen!

5. Primary Antibodies

1. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 1x PBS und fügen Sie die Lösung für die Gerichte (VDAC1 Maus-Antikörper: 1/100, IP3R1 Kaninchen-Antikörper: 1/500). Alternativ Grp75 oder CypD Antikörper (beide Maus-Antikörper bei 1/500 verwendet wird) kann anstelle von VDAC1 verwendet werden.
2. Inkubieren über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Tris-gepufferte Salzlösung mit 0,01% Tween (TBS-T).

6. Proximity Ligatur Assay Probes

1. Proximity-Ligation-Assay-Sonden werden von dem Kit zur Verfügung gestellt. Wählen Sonden entsprechend den Arten von primären Antikörpern.
2. Bereiten Sie die beiden Proximity Ligation Assay-Sonden 1: 5 in Antikörperverdünnung. Lassen Sie die Mischung 20 min bei RT zu sitzen. Fügen Sie die verdünnte Nähe Ligatur Assaysonde Lösung. Inkubieren des Geschirrs in einem vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für 1 h bei 37 ° C. Waschen Sie die Gerichte zweimal mit TBS-T.

7. Ligatur

1. Verwenden Sie die in - situ - Nachweisreagenz Texas rot - Kit.
2. Verdünnen Sie die 5-fach Ligatur Lager (zur Verfügung gestellt von dem Kit) 1: 5 in hochreinem Wasser und gut mischen. Verdünnen Sie die Ligase in 1x Ligierungslösung (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 01.40 und Wirbel. Warten, um die Ligase hinzuzufügen, bis unmittelbar vor der Zugabe zu den Proben.
3. Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen) und Inkubation der Objektträger in einem vorgewärmten Feuchtigkeit chamber für 30 min bei 37 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit TBS-T.

8. Amplification

HINWEIS: Achten Sie darauf, lichtempfindliche Reagenzien.

1. Verdünnen Sie die 5-fach Verstärkung Lager (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1: 5 in hochreinem Wasser. Entfernen Sie die Polymerase aus der Tiefkühltruhe mit dem Gefrierblock (-20 ° C). Verdünnen Sie die Polymerase (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1:80 in der 1x Verstärkerlösung und Wirbel. Fügen Sie die Polymerase unmittelbar vor der Mischung verwendet wird.
2. Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen). Inkubieren der Objektträger in einem vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Folien.

9. Schluss Waschen

1. Waschen Sie die Folien in 1x SSC Waschpuffer für 2 min. Waschen Sie die Folien in 0,01x SSC Waschpuffer für 2 min. Lassen Sie die Gerichte im Dunkeln bei RT trocknen.

10. Vorbereitung für Imaging

1. Montieren Sie die Folien ein minimales Volumen von Montagemedium enthält DAPI (wässrige und nicht erstarrt), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Deckglas verfangen. Nagellack kann verwendet werden, um die Kanten zu versiegeln. Warten Sie ca. 15 Minuten vor der Verwendung eines Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop zu analysieren (Anregung: 594 nm, Emission: 624 nm, Vergrößerung: 63X).
2. Nach der Bebilderung, speichern Sie die Objektträger bei -20 ° C im Dunkeln.

Ergebnisse

Basierend auf unserer Erfahrung dieses Protokoll verwenden, können wir diese Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen sicher zu empfehlen. Repräsentative Bilder von in situ Proximity Ligation Assay-visualisierten ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in der HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie unter Verwendung von mehreren Paaren von Antikörpern, gezeigt. Wie in Figur 2 durch Fluoreszenzmikroskopie gezei...

Diskussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html