JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем процедуру визуализации и количественной оценки с высокой чувствительностью эндогенные взаимодействия между эндоплазматического ретикулума и митохондрий в фиксированных клетках. Протокол оснащен оптимизированной Ситу лигирования анализа близости в ориентации инозита 1,4,5-трифосфат / белок глюкозы регулируемого рецептора 75 / зависящие от напряжения анион канала / циклофилин D комплекса на границе раздела мембраны митохондрии-ассоциированной.

Аннотация

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Введение

Митохондрии и эндоплазматический ретикулум (ЭР) не являются независимыми органелл в клетке, но они взаимодействуют конструктивно и функционально на контактных участках, определенных в качестве митохондриальной ассоциированный эндоплазматического ретикулума мембраны (МАМ). На самом деле, MAMS соответствуют областям, где мембраны ЭР и митохондрии тесно соединенный, позволяя взаимодействия между белками с обеих сторон. Тем не менее, мембраны этих органелл не сливаться в этих регионах, поэтому они сохраняют свои отдельные объекты. В MAMS играют решающую роль в кальция (Ca 2+) и фосфолипидов перенос из ER в митохондрии, воздействуя энергетический метаболизм и выживание клеток 1-3.

Связь между ER и митохондрий впервые была визуализирована в 1970-е годы с электронной микроскопии. С тех пор, просвечивающая электронная микроскопия 4,5, электронная томография 6,7 или иммуно-локализация ER и митохондрии конкретных флуорофорас / флуоресцентные белки , 8 были классически использованы для изучения ER-митохондрии взаимодействий. Еще один полезный инструмент для анализа МАМ основан на использовании внутриклеточного фракционирования. Это позволяет изолировать МАМ фракций путем дифференциального ультрацентрифугирования , соединенного с градиентом Percoll 9. Тем не менее, конечный продукт содержит обогащенные MAM фракции, а не чистых фракций. В целом, эти стратегии не являются особенно чувствительными и / или количественный характер, и они не легко поддаются большой скрининга. В качестве альтернативы, генетические подходы , использующие наркотики индуцируемого флуоресцентных между органелл линкеры появились, но они не позволяют анализ органелл взаимодействий на эндогенные уровни экспрессии белков 10.

На основании открытия Szabadkai о комплексе IP3R / GRP75 / VDAC в МАМ 11, мы разработали количественный метод для анализа ER-митохондрии взаимодействий. Мы использовали на месте близости ligati вна анализе для выявления и количественной оценки взаимодействий между VDAC1 и IP3R1, два органелл поверхностные белки , участвующие в -channeling комплекса Са 2+ на границе раздела МАМ в фиксированных ячейках 12. Коротко говоря, мы зондировали VDAC1 на внешней мембране митохондрий (мышиное анти-VDAC1 первичного антитела) и IP3R1 на ER мембране (кроличье анти-IP3R1 первичным антителом) (рис 1, а) панели. Затем, в соответствии с анализом, мы добавили как анти-мышь и анти-кроличьего IgG (мыши и кролика Пробирной Расстояние Лигирование зонды), которые сопрягаются с комплементарными олигонуклеотидными расширений. Если две целевые белки находятся на расстоянии менее 40 нм, олигонуклеотиды могут гибридизоваться с последовательно добавляют олиго разъем для того чтобы позволить формирование шаблона круговой ДНК (рисунок 1, б) панель. Эта круговая молекула ДНК лигируют и усиливается, создавая одноцепочечной ДНК продукт , ковалентно присоединенную к одному из бесконтактными датчиками (фиг.1, панель C) . Так как расстояние между ER и митохондрии на границе раздела МАМ в диапазоне от 10 нм до 25 нм , 6, близость Лигирование и усиление может быть сделано, что приводит к последующему обнаружению вследствие гибридизации техасский красный-меченных зондов (рисунок 1, Панель D ). Каждая люминесцентная точка представляет взаимодействие между VDAC1 / IP3R1, что позволяет количественно оценить на месте ER-митохондрии взаимодействий в отдельных клетках.

figure-introduction-3698
Рисунок 1: Схематическое изображение обнаружения эндоплазматического ретикулума-митохондриях взаимодействий по In Situ Пробирной Расстояние Лигирование. а) первичной мыши антитело , направленное против VDAC1 и кролика первичным антителом , направленным против IP3R1 могут связываться с их эпитопов в непосредственной близости на границе раздела МАМ, б) добавление пары зондов Расстояние Лигированиенаправленной против мыши и кролика IgG. Эти зонды прикрепили нити ДНК, которые могут образовывать шаблоны для перевязки соединителя олиго. в) Круговая нить ДНК образована после перевязки может быть усилено и d) с помощью микроскопии визуализированы в качестве флуоресцентного точки, используя техасский красный-меченных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Аналогичные эксперименты анализа Situ близость лигирования в может быть выполнена с GRP75 / IP3R1 пары антител, а также циклофилина D (CypD) / IP3R1 антитела, принимая во внимание , что CypD было показано взаимодействие с комплексом IP3R / GRP75 / VDAC на границе раздела МАМ 12-14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 10% формальдегида в PBS (с низким содержанием соли) путем разбавления 5,5 мл 37% формальдегида в 14,5 мл PBS. Готовят 1 М глицина, рН 8,0, при растворении 3,8 г глицина в 50 мл PBS; разбавить этот раствор, чтобы получить 100 мМ глицина в 1x PBS.
  2. Готовят 0,1% Triton-X100 в 1x PBS. Готовят 20x Saline цитрат натрия (SSC) с использованием 3,0 М хлорида натрия и 0,30 М тринатрийцитрат, полученный в деионизированной воде буфере с рН 7,0 при 25 ° C. Развести этот буфер для 1x и 0.01x с использованием деионизированной воды.

2. Фиксация клеток

Примечание: Мы использовали линию клеток гепатокарцинома HuH7 в данном исследовании, но этот метод применим к другим адгезивных клеточных культур.

  1. Пластинчатые HuH7 клетки (культивированные в среде DMEM 1 г / л глюкозы, с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и 0,01% пенициллина-стрептомицина) в наличии 150000 клеток на немелованной 35-мм со стеклянным дном блюдо. При работе на первичной ячейкекультуры, используют коллаген покрытием блюд.
  2. На следующий день, удалить культуральной среды. Вымойте клеток с 1 мл PBS и аспирата. Зафиксировать клетки, путем добавления 1 мл 10% формальдегида и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) при перемешивании.
  3. Остановить реакцию с 1 мл 1 М глицина и перемешать с помощью вращения. Удалите реакционный стоп раствор и промыть клетки путем добавления 1 мл 1x PBS; перемешивать вращением и аспирата. Добавить 1 мл 100 мМ глицина к клеткам и инкубируют их в течение 15 мин при комнатной температуре при перемешивании, а затем аспирата.
    Примечание: Протокол может быть остановлен здесь и следующие шаги могут быть перенесено на другой день. В этом случае, прибавляют 1 мл 100 мМ глицина и хранить при температуре 4 ° С, при необходимости.

3. пермеабилизирующего КЛЕТОК

  1. Добавить 1 мл 0,1% Triton-X100 в 1x PBS, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре при перемешивании, а затем аспирата. Это время инкубации может быть увеличено до 15 - 20 мин при работе на первичной клеточной КУЛЬТУРАэс (например, первичные гепатоциты мышей). Вымойте клеток путем добавления 1 мл 1x PBS; аспирата.

4. Блокирование

  1. Добавьте 40 мкл блокирующего раствора для каждого образца (при условии, комплектом); этот объем может быть увеличен для того, чтобы покрыть образец. Инкубируйте блюда в течение 30 мин при 37 ° С во влажной камере.
  2. Нажмите блокирующую решение прочь блюд. Постарайтесь получить равные остаточные объемы для каждого слайда, так как это будет влиять на воспроизводимости. Не позволяйте образцы высохнуть!

5. Первичные антитела

  1. Развести первичных антител в 1x PBS и добавляют раствор к блюдам (VDAC1 антитела мыши: 1/100, IP3R1 кролика антитела: 1/500). В качестве альтернативы, GRP75 или CypD антитела (оба мышиные антитела, используемые в 1/500) могут быть использованы вместо VDAC1.
  2. Выдержите в течение ночи во влажной камере при 4 ° С. Вымойте слайды два раза с использованием Tris-солевом буферном растворе с 0,01% Tween (TBS-T).
6. Пробирной Расстояние Лигирование Зонды

  1. Пробирной Расстояние Лигирование зондов обеспечиваются комплектом. Выбор зондов в зависимости от вида первичных антител.
  2. Приготовьте два Пробирной Расстояние Лигирование зондов 1: 5 в разбавителе антитела. Разрешить смесь сидеть в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавьте разведенный близость перевязки раствора для анализа зонда. Инкубируйте блюда в камере предварительно нагретую влажности в течение 1 часа при 37 ° С. Мыть посуду два раза TBS-T.

7. Лигирование

  1. С помощью Ситу реагента обнаружения Texas красный комплект в.
  2. Развести перевязки запас 5x (поставляемый комплект) 1: 5 в воде высокой чистоты и хорошо перемешать. Развести лигазы в растворе 1х лигирования (предоставляется комплект) 1:40 и вихрь. Подождите, чтобы добавить лигазы до момента непосредственно перед добавлением к образцам.
  3. Добавьте это решение каждого образца (40 мкл для 35-мм стеклянным дном посуды) и инкубировать слайды в чам предварительно нагретой влажностиBER в течение 30 мин при температуре 37 ° С. Вымойте слайды два раза TBS-T.

8. Amplification

Примечание: Будьте осторожны, светочувствительные реагенты.

  1. Развести 5x усиления запаса (при условии, комплектом) 1: 5 в воде высокой чистоты. Удалите полимераза из морозильника использованием замораживания блока (-20 ° С). Развести полимеразы (поставляемый комплект) 1:80 в 1х растворе и усиления вихря. Добавьте полимеразу непосредственно перед использованием смеси.
  2. Добавьте это решение каждого образца (40 мкл для 35-мм стеклянным дном посуды). Инкубируйте слайдов в камере предварительно нагретую влажности в течение 100 мин при 37 ° С. Нажмите Amplification-полимеразной решение выключить из слайдов.

9. Окончательный Стиральная

  1. Вымойте слайды в 1x SSC буфером для промывки в течение 2 мин. Вымойте слайды в 0.01x SSC буфера для промывки в течение 2 мин. Пусть блюда высохнуть при комнатной температуре в темноте.

10. Подготовка к визуализации

  1. Установите слайды, используя минимальный объем монтажной среды, содержащей DAPI (водный и не затвердевает), убедившись, что пузырьки воздуха не попадают под покровным. Лак для ногтей может быть использован для герметизации краев. Подождите примерно 15 минут до анализа с использованием флуоресценции или конфокальной микроскопии (возбуждение: 594 нм, эмиссия: 624 нм, коэффициент увеличения: 63X).
  2. После того, как изображения, хранить слайды при температуре -20 ° С в темноте.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Основываясь на нашем опыте, используя этот протокол, мы можем смело рекомендовать этот метод для визуализации и количественного ER-митохондрии взаимодействий в фиксированных клетках. Типичные изображения Ситу Пробирной Расстояние Лигирование-визуализируется ER...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

Мы благодарим всех людей в нашей лаборатории, которые способствовали оптимизации и проверки протокола. Эта работа была поддержана INSERM и национальным исследовательским агентством (ANR-09-JCJC-0116 И ANR-11-BSV1-033-02). ET была поддержана во время ее PhD по научным стипендии от французского министерства высшего образования и научных исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
FormaldehydeSigmaF-8775
GlycineSigmaG-8898
TritonSigmaT8532
35 mm Glass bottom culture dishesMatTeK corporationP35G-0-14-C
Blocking solutionSigmaDUO-92004 or DUO-92002provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibodyAbcamab14734
IP3R1-H80 antibodySanta Cruzsc28614
CypD antibodyAbcamab110324
Grp75 antibodySanta Cruzsc13967
TBS 10xeuromedexET220Dilute to obtain 1x
Tween 100xeuromedex2001-Bdilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUSSigmaDUO-92004Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUSSigmaDUO-92002Duolink, Sigma
Duolink detection reagents redSigmaDUO-92008Duolink, Sigma
Ligation solutionSigmaDUO-92008Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
LigaseSigmaDUO-92008Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solutionSigmaDUO-92008Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
PolymeraseSigmaDUO-92008Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting MediumSigmaDUO80102Duolink, Sigma
Softwares
Blob-finder softwareBlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ softwareCan be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

Ссылки

  1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
  2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
  3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
  4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169(2012).
  5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
  6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
  7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
  8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
  9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
  10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
  12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
  13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
  14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
  15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
  16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
  17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
  19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
  20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

118VDACIP3R

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены