Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure pour visualiser et de quantifier avec une grande sensibilité les interactions endogènes entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans les cellules fixes. Le protocole optimisé comprend un essai de ligature de proximité in situ dans le ciblage de l'inositol 1,4,5-triphosphate récepteur / protéine régulée par le glucose 75 / D complexe canal anionique / cyclophiline dépendant de la tension à l'interface de la membrane associée à la mitochondrie.

Résumé

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Mitochondrie et le réticulum endoplasmique (ER) ne sont pas indépendants dans les organites de la cellule, mais ils interagissent structurellement et fonctionnellement au niveau des sites de contact définis comme membranes du réticulum endoplasmique mitochondries-associés (MAM). En effet, MMA propres correspondent à des régions où les membranes du RE et les mitochondries sont étroitement apposés, ce qui permet des interactions entre les protéines des deux côtés. Néanmoins, les membranes de ces organites ne fusionnent pas dans ces régions, de sorte qu'ils maintiennent leurs entités distinctes. Les jouent un rôle MMA propres crucial dans le calcium (Ca ²⁺⁾ et transfert des phospholipides d'ER aux mitochondries, un impact sur le métabolisme énergétique et la survie des cellules ^1-3.

L'association entre l'ER et des mitochondries a été visualisé dans les années 1970 avec la microscopie électronique. Depuis lors, la microscopie électronique à transmission , ^{4,5, 6,7} tomographie électronique ou immuno-localisation de ER et spécifiques aux mitochondries fluorophores / protéines fluorescentes ⁸ ont été classiquement utilisés pour étudier les interactions ER-mitochondries. Un autre outil utile pour l'analyse du MAM est basée sur l'utilisation de fractionnement subcellulaire. Elle permet l'isolement des fractions par ultracentrifugation différentielle MAM couplé à un gradient de Percoll ^9. Cependant, le produit final contient des fractions enrichies MAM, plutôt que des fractions pures. Au total, ces stratégies ne sont pas particulièrement sensibles et / ou quantitative, et ils ne sont pas facilement se prêtent à une grande sélection. Alternativement, des approches génétiques utilisant fluorescentes linkers inter-organelles de drogue inductible sont apparus, mais ils ne permettent pas l'analyse des interactions des organites aux niveaux d'expression de protéines endogènes ^10.

Sur la base de la découverte de Szabadkai du complexe IP3R / GRP75 / VDAC au MAM ^11, nous avons développé une méthode quantitative pour analyser les interactions ER-mitochondries. Nous avons utilisé le in situ la proximité ligatile dosage pour détecter et quantifier les interactions entre les VDAC1 et IP3R1, deux protéines de surface des organites impliqués dans le complexe -channeling ^{Ca2 +} à l'interface MAM dans les cellules fixes ^12. En bref, nous avons sondé VDAC1 à la membrane externe mitochondriale (souris anticorps primaire anti-VDAC1) et IP3R1 à la membrane du RE (lapin anticorps primaire anti-IP3R1) (figure 1, le panneau a). Ensuite, selon le dosage, on a ajouté à la fois anti-souris et anti-lapin IgG (de sondes de dosage de souris et de lapin proximité de ligature), qui sont conjugués à des extensions d'oligonucléotides complémentaires. Si les deux protéines ciblées sont à une distance inférieure à 40 nm, les oligonucléotides peuvent hybrider avec les oligos de connecteur ajoutés ultérieurement pour permettre la formation d'une matrice d'ADN circulaire (Figure 1, panneau b). Cette molécule d'ADN circulaire est ligaturé et amplifié, en créant un produit d'ADN simple brin lié par covalence à l' un des capteurs de proximité (Figure 1, panneau c) . Comme la distance entre l'ER et les mitochondries à l'interface MAM varie de 10 nm à 25 nm ^6, la proximité ligature et l' amplification peuvent être réalisées, conduisant à une détection ultérieure en raison de l'hybridation de Texas oligonucléotides rouges-sondes marquées (Figure 1, panneau d ). Chaque point fluorescent représente les interactions entre VDAC1 / IP3R1, permettant ainsi la quantification in situ des interactions ER-mitochondries dans des cellules individuelles.

Figure 1: Illustration schématique de la détection des interactions réticulum endoplasmique-mitochondries par In Situ Proximité Ligation Assay. a) un anticorps primaire de souris dirigé contre VDAC1 et un anticorps primaire de lapin dirigé contre IP3R1 peuvent se lier à leurs epitopes à proximité de l'interface MAM, b) l'addition d'une paire de sondes de ligature de proximitédirigé contre la souris et le lapin IgG. Ces sondes sont attachés brins d'ADN qui peuvent former des modèles pour la ligature des oligonucléotides de connecteur. c) Le brin d'ADN circulaire formé après la ligature peut être amplifié , et d) visualisées par microscopie à fluorescence comme un point à l'aide du Texas oligonucléotides marqués au rouge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Comme dans les expériences d'analyse in situ la proximité de ligature peut être réalisée avec la paire GRP75 / IP3R1 d'anticorps, ainsi que la cyclophiline D (CypD) / anticorps IP3R1, considérant que CypD a été montré pour interagir avec le complexe IP3R / GRP75 / VDAC à l'interface de MAM ^12-14.

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparer 10% de formaldehyde dans du PBS (faible teneur en sel) en diluant 5,5 ml de formaldéhyde à 37% dans 14,5 ml de PBS. Préparer glycine 1 M, pH 8,0, en dissolvant 3,8 g de glycine dans 50 ml de PBS; diluer cette solution pour obtenir la glycine 100 mM dans PBS 1x.
2. Préparer 0,1% de Triton-X100 dans PBS 1x. Préparer 20x Saline citrate de sodium (SSC) en utilisant 3,0 M de chlorure de sodium et 0,30 M de citrate trisodique préparé dans un tampon d'eau déminéralisée avec un pH de 7,0 à 25 ° C. Diluer ce tampon à 1x et 0,01x en utilisant de l'eau déminéralisée.

2. Fixation de cellules

NOTE: Nous avons utilisé la lignée cellulaire d'hépatocarcinome HuH7 dans cette étude, mais cette méthode est applicable à d' autres cultures de cellules adhérentes.

1. cellules de plaques HuH7 (cultivées en DMEM 1 g / L de glucose, additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,01% de pénicilline-streptomycine stock) à 150.000 cellules par boîte à fond de verre de 35 mm non couché. Lorsque vous travaillez sur cellule primairecultures utilisent des boîtes revêtues de collagène.
2. Le lendemain, retirer le milieu de culture. Laver les cellules avec 1 ml de PBS et aspirée. Fixer les cellules en ajoutant 1 ml de formol à 10% et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante (TA) sous agitation.
3. Stopper la réaction avec 1 ml de glycine 1 M et mélanger en rotation. Retirer la solution de réaction d'arrêt et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS 1x; agiter par rotation et aspirez. Ajouter 1 ml de glycine 100 mM dans les cellules et les incuber pendant 15 min à température ambiante sous agitation, puis aspirée.
   NOTE: Le protocole peut être arrêté ici et les étapes suivantes peut être reporté à un autre jour. Dans ce cas, ajouter 1 ml de glycine 100 mM et de garder à 4 ° C, si nécessaire.

3. La perméabilisation de cellules

1. Ajouter 1 ml de 0,1% de Triton X100 dans du PBS 1X, incuber pendant 15 min à température ambiante sous agitation, puis aspirat. Ce temps d'incubation peut être augmentée jusqu'à 15 - 20 min lorsque l'on travaille sur des cellules primaires cultures (par exemple, les hépatocytes de souris primaires). Laver les cellules en ajoutant 1 ml de 1 x PBS; aspirer.

4. Blocage

1. Ajouter 40 ul de solution de blocage à chaque échantillon (fourni par le kit); ce volume peut être augmenté afin de couvrir l'échantillon. Incuber les boîtes pendant 30 minutes à 37 ° C dans une chambre humide.
2. Appuyez sur la solution de blocage de la vaisselle. Essayez d'obtenir des volumes résiduels égaux pour chaque diapositive, car cela aura une incidence sur la reproductibilité. Ne pas laisser les échantillons sécher!

5. Anticorps primaires

1. Diluer les anticorps primaires 1x PBS et ajouter la solution aux plats (d'anticorps de souris VDAC1: 1/100, anticorps de lapin IP3R1: 1/500). Alternativement, GRP75 ou CypD anticorps (les deux anticorps de souris utilisés au 1/500) peuvent être utilisés à la place de VDAC1.
2. Laisser incuber pendant une nuit dans une chambre humide à 4 ° C. Laver les lames deux fois en utilisant une solution saline tamponnée Tris avec 0,01% de Tween (TBS-T).

6. Proximité ligatures Assay Sondes

1. A proximité des sondes d'essai de ligature sont fournis par le kit. Choisir des sondes selon l'espèce d'anticorps primaires.
2. Préparer les deux proximité sondes de dosage de ligature 1: 5 dans le diluant d'anticorps. Laisser le mélange reposer pendant 20 min à température ambiante. Ajouter la solution de sonde d'essai de proximité de ligature dilué. Incuber les plats dans une chambre d'humidité préchauffé pendant 1 heure à 37 ° C. Laver les plats deux fois avec TBS-T.

7. ligature

1. Utilisez le dans le réactif de détection in situ Texas kit rouge.
2. Diluer la ligature stocks 5x (fourni par le kit) 1: 5 dans de l'eau de haute pureté et bien mélanger. Diluer la ligase dans la solution de ligature 1x (fournie dans le kit) et 1:40 vortex. Attendez d'ajouter la ligase jusqu'à immédiatement avant l'addition aux échantillons.
3. Ajouter cette solution à chaque échantillon (40 pi pour les plats à fond de verre de 35 mm) et incuber les lames dans un cham d'humidité pré-chaufféeber pendant 30 min à 37 ° C. Laver les lames deux fois avec du TBS-T.

8. Amplification

REMARQUE:, des réactifs sensibles à la lumière avec soin.

1. Diluer la 5x amplification stock (fournie par le kit) 1: 5 dans de l'eau de haute pureté. Retirer la polymérase du congélateur au moyen du bloc de congélation (-20 ° C). Diluer la polymerase (fourni par le kit) à 1:80 dans la solution d'amplification 1x et vortexer. Ajouter la polymérase immédiatement avant d'utiliser le mélange.
2. Ajouter cette solution à chaque échantillon (40 pi pour les plats à fond de verre de 35 mm). Incuber les lames dans une chambre humide préchauffé pendant 100 minutes à 37 ° C. Appuyez sur la solution Amplification-Polymerase hors des diapositives.

9. Lavage final

1. Laver les lames dans un tampon de lavage 1x SSC pendant 2 min. Laver les lames dans un tampon de lavage SSC 0,01x pendant 2 min. Laissez les plats sécher à la température ambiante dans l'obscurité.

10. Préparation pour l'imagerie

1. Monter les lames en utilisant un volume minimal de milieu de montage contenant DAPI (aqueux et ne se solidifie pas), en veillant à ce qu'aucune bulle d'air se coincer sous la lamelle. Vernis à ongles peut être utilisé pour sceller les bords. Attendez environ 15 minutes avant d'analyser en utilisant une fluorescence ou microscope confocal (excitation: 594 nm, émission: 624 nm, grossissement: 63X).
2. Après l'imagerie, stocker les lames à -20 ° C dans l'obscurité.

Résultats

Sur la base de notre expérience en utilisant ce protocole, nous pouvons recommander en toute sécurité de cette méthode pour la visualisation et la quantification des interactions ER-mitochondries dans les cellules fixes. Des images représentatives de à proximité ligature interactions in situ de dosage-visualisées ER-mitochondries dans la lignée cellulaire HuH7 d'hépatocarcinome, en utilisant plusieurs paires d'anticorps, sont présentés. Comme on le v...

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html