Co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate

Resumen

Hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones en Rosa26 ^tdtomato (ubicuamente expresado en todas las células) / Cre (expresa específicamente en condrocitos) ratones: uno con 2.3Col1a1-GFP (específico para los osteoblastos) y uno con inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran la transformación directa de los condrocitos en las células óseas.

Resumen

El sistema de rastreo de linaje de células se ha utilizado predominantemente en los estudios de biología del desarrollo. El uso de la recombinasa Cre permite la activación del reportero en una línea celular específica y toda la progenie. En este caso, se utilizó la línea celular de rastreo técnica para demostrar que los condrocitos se transforman directamente en los osteoblastos y los osteocitos durante hueso largo y el desarrollo cóndilo mandibular utilizando dos tipos de Cre, Col10a1-Cre y Aggrecan-Cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2), cruzamos con Rosa26 ^tdTomato. Tanto Col10 y agrecano son marcadores bien reconocidos por los condrocitos.

Sobre esta base, hemos desarrollado un nuevo linaje de células método de seguimiento en relación con el destino de células inmunohistoquímica para definir fluorescente mediante el análisis de la expresión de marcadores de células específicas. Runx2 (un marcador de células osteogénicas en fase inicial) y la dentina protein1 matriz (DMP1, un marcador para las células de la última etapa osteogénicas) eranse utiliza para identificar las células óseas de condrocitos derivados y su estado de diferenciación. Esta combinación no sólo amplía la aplicación de rastreo de linaje de células, sino que también simplifica la generación de ratones compuestos. Más importante aún, los estados de número, ubicación, y la diferenciación de la progenie celular parental se muestran simultáneamente, proporcionando más información de la línea celular de rastreo solo. En conclusión, la co-aplicación de técnicas de trazado de linaje celular y de inmunofluorescencia es una herramienta poderosa para la investigación de biología celular in vivo.

Introducción

Durante el desarrollo, la formación de hueso endocondral representa más del 80% del volumen esquelético. Se cree ampliamente que comienza con la apoptosis de los condrocitos hipertróficos. Posteriormente, las células de la médula ósea subyacente invaden y iniciar la angiogénesis, seguido por la deposición de hueso nuevo por marrow- ósea y células derivadas de periostio ^1,2. El destino celular de condrocitos hipertróficos (HC), sin embargo, ha sido un tema de debate durante décadas ^3. Inicialmente, los HC se considera que el final de la vía de diferenciación de condrocitos, y la apoptosis en general se piensa que es el destino final de los HC. Ahora, algunos investigadores sugieren que al menos algunos HC podrían sobrevivir y contribuir a la formación de hueso endocondral. A pesar de que propusieron que el crecimiento de condrocitos placa tenían la capacidad de transdifferentiate en osteoblastos sobre la base de ultraestructura, tinción inmunohistoquímica, y los estudios in vitro ^{de 46 años,} ninguno de estos métodos were definitiva para demostrar la contribución de los condrocitos al linaje de osteoblastos.

La técnica de rastreo de linaje celular proporciona una manera más rigurosa para estudiar el destino celular. En pocas palabras, una enzima recombinasa, que sólo se expresa en un tipo específico de célula, estimula la expresión del gen reportero. De esta manera, este tipo de células y sus descendientes son etiquetados de forma permanente ^7. El sistema Cre-loxP se utiliza comúnmente en el rastreo de linaje. Cre (la enzima recombinasa) será escindir la secuencia de parada entre los dos sitios loxP y activar el reportero en una línea celular específica (Figura 1A). En algunos casos, el investigador puede elegir un punto de tiempo favorable para activar Cre mediante el uso de un fármaco, tal como tamoxifeno, causando Cre para fusionar a una forma modificada del receptor de estrógeno (Cre ^{ERT2) 8.} reporteros fluorescentes han convertido en el estándar en el linaje de rastreo experimentos, ya que reducen drásticamente la complejidady mejorar la precisión y la eficiencia de la celda destino de rastreo ^8,9. tdTomato se está convirtiendo en la mejor elección entre los reporteros fluorescentes ya que tiene la proteína fluorescente más brillante y la más fuerte de epifluorescencia, lo que es fácilmente visualizada ⁷ (Figura 1A).

Al utilizar el linaje Rosa26 ^tdTomato sistema de rastreo, nuestro grupo y otros investigadores han demostrado que los HC puede cambiar su fenotipo en células óseas durante el desarrollo ^10-14. Para lograr esto, hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones con Rosa26 ^tdtomato (expresión ubicua en todas las células) / Cre (específico de condrocitos) ratones: 2.3Col1a1-GFP (específico de osteoblastos) e inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran que ambos métodos son formas viables para estudiar el destino de células in vivo.

Protocolo

Todos los protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Texas A & M University College of Dentistry.

Cría de Animales 1.

1. Use tres modelos animales en este estudio. Para investigar el destino de los condrocitos embrionarios en la formación de cóndilo, primer uso Col10a1 ^Cre-15 ratones y cruzarlos con Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{TM9 (CAG-tdTomato) Hze} / J) para obtener ratones Col10a1- Cre ratones y Rosa26 ^tdTomato. A continuación, cruzar estos ratones con ratones 2.3Col1a1 ^16-GFP. Utilice Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP para llevar a cabo los experimentos de rastreo de linaje de células (Figura 1B).
2. Para estudiar el destino de los condrocitos postnatales, siga el mismo procedimiento que en el paso 1.1, pero el uso de la ^ERT2 Aggrecan cre-(Agg-Cre ^ERT2) ^17,18 línea y mantener la AGG-Cre ^ERT2; Rosa26 ^tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP para llevar a cabo los experimentos de rastreo de linaje de células (Figura 1C). Inyectar el tamoxifeno en el día postnatal 14.
3. Para combinar el linaje de células trazando técnica de inmunofluorescencia, cruzar ratones Agg-Cre ^ERT2 y ratones Rosa26 ^tdTomato. Utilice los ratones que llevan ambos genes en el experimento e inyectar el tamoxifeno en el día postnatal 3 (Figura 1D).

2. Preparación de materiales

1. Disolver el polvo tamoxifeno en 10% de etanol y aceite de maíz 90% a una concentración de 10 mg / ml. La dosis para la inyección es de 75 mg / kg.
2. Disolver el polvo de paraformaldehído (PFA) en PBS a una concentración de 4%, utilizando hidrato de sodio 2 M para ajustar el valor pH a 7,4. Use la solución PFA 4% para fijar el tejido (el cóndilo mandibular y la pata trasera se utilizan aquí) después del sacrificio. Debido a sutoxicidad, manejar PFA en la campana con guantes y una mascarilla.
3. Disolver el polvo EDTA en agua destilada a una concentración de 10%, utilizando hidrato de sodio 2 M para ajustar el valor pH a 7,4. Utilice 10% EDTA para descalcificar el cóndilo mandibular y la pata trasera.
4. Disuelva el polvo de sacarosa en PBS a concentraciones de 15% y 30%. Utilice la solución de sacarosa para deshidratar el tejido después de la descalcificación.
5. Disolver el polvo hialuronidasa en PBS a una concentración de 2 mg / ml, pH 5,0. Esta solución es para la recuperación de antígeno por inmunofluorescencia.
6. Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de bloqueo que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y suero de cabra al 20% en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia.
7. Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de anticuerpo primario que contiene 2% de suero de cabra en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. La concentración del anticuerpo primario es de 1: 400 para Runx2 y 1: 100 para DMP1.
8. Use un tubo de 1,5 ml para prepararla solución de IgG de conejo como el control para la tinción de inmunofluorescencia para evitar resultados falsos positivos. La solución contiene 2% de suero de cabra en PBS. La concentración de la IgG de conejo para el control Runx2 es 1: 400; para DMP1, 1: 100. Realizar el experimento y el control de la tinción de forma simultánea.
9. Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de anticuerpo secundario que contiene 2% de suero de cabra en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. Utilice el anticuerpo secundario a una dilución de 1: 500.

3. Preparación de los portaobjetos de microscopía confocal (linaje celular rastreo solamente, ninguna combinación con inmunofluorescencia)

1. Inyectar el tamoxifeno en el cre-Agg ^ERT2 ratones en un punto de tiempo favorable.
   1. En primer lugar, eliminar un ratón de su jaula. A continuación, utilice el pulgar y el dedo índice izquierdo para agarrar la piel en la parte posterior del ratón y darle la vuelta, dejando al descubierto el abdomen. Utilice la mano derecha para sostener la jeringa. El punto de entrada óptimo para la inyección es en la lEFT oa la derecha de hipogastrio, evitando el hígado y la vesícula.
   2. Mantener la jeringa en paralelo a las patas traseras del ratón y se inyecta por vía intraperitoneal. La dosis para la inyección es de 75 mg / kg. Los pesos de los ratones a las edades de 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas de edad son aproximadamente 7 - 9 g, 11 - 13 g, y 16 - 18 g, respectivamente.
2. Anestesiar a los ratones con una combinación xilazina / Ketaset.
   1. Para preparar la solución de trabajo, diluir primero la xilazina y Ketaset con agua destilada a una concentración de 1 mg / ml y 5 mg / ml, respectivamente. A continuación, mezclar la xilazina y Ketaset en una proporción de 1: 2. La dosificación para inyección es 30 l / g.
   2. Inyectar como en el paso 3.1. Confirmar la anestesia pellizcando el tobillo del ratón. El ratón está inconsciente si no tiene una reacción.
3. Perfundir los ratones con PFA al 4% después de la anestesia.
   1. Después de que el ratón pierde la conciencia, fijar las cuatro patas del ratón sobre una tabla de entirely exponer el abdomen.
   2. Saturar el abdomen con un 70% de etanol y hacer una escisión de la parte inferior del abdomen hasta el cuello a lo largo de la línea media. Pellizcar y simultáneamente tirar de la piel a los lados laterales para revelar la membrana peritoneal. Use las tijeras de disección para hacer una escisión longitudinal.
   3. Cortar y quitar las costillas delanteras para exponer el corazón. Perforar el corazón del ventrículo izquierdo con una jeringa de 22 G, mantenga la jeringa, y al mismo tiempo cortar una ranura en la aurícula derecha.
   4. Lentamente inyectar el 4% PFA, que se perfundió a lo largo del sistema cardiovascular mientras que los rubores de sangre fuera del corte de la aurícula derecha. El volumen de la PFA para la perfusión es 1 ml / gramo. Realice este paso en una cabina de bioseguridad de Clase I que es difícil de tuberías para el sistema de salida del edificio.
4. Retire la piel del ratón y puso todo el cuerpo en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml que contiene 40 ml de PFA al 4% para fijar la noche a 4 ° C.
5. Use las tijeras de disección y # 3 y # 5 pinzas para retirar con cuidado la mandíbula y la pata trasera del cuerpo y para eliminar los músculos y los tendones en la superficie. Realice este paso en una cabina de bioseguridad de Clase I que es difícil de tuberías para el sistema de salida del edificio.
6. Cortar la mandíbula en dos artículos en la región distal del tercer molar. Del mismo modo, cortar el fémur y la tibia en la mitad del tallo para exponer la cavidad de la médula ósea a fin de acelerar la descalcificación. Ponga la parte que incluye el proceso cóndilo y condilar y junto con la pata trasera en 40 ml de 10% de EDTA para descalcificar a 4 ° C durante 2 - 4 días en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
7. Usar 50 ml de 15% de sacarosa para deshidratar el cóndilo y la pata trasera durante la noche a 4 ° C en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
8. Utilice 30% de sacarosa para deshidratar el cóndilo y la pata trasera durante la noche a 4 ° C en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
9. A lo largo del plano sagital, incrustar la muestra conPTU respecto de la placa de corte en la máquina criogénica.
   1. Horizontalmente sentar las cóndilo o la pata trasera en el molde de montaje. Sumergir el tejido en OCT y dejarlo en la máquina criogénica hasta la OCT se congela.
   2. Montar el bloque de PTU respecto de la placa de corte. Esperar aproximadamente 15 min antes de cortar para asegurar que el OCT es completamente congelado.
10. Cortar el cóndilo y la pata trasera en secciones de 10 micras. Recoger las secciones en portaobjetos y se almacena a -20 ° C.
11. Incubar el portaobjetos en una cámara de 37 ° C para eliminar el agua antes de la tinción.
12. Lavar los portaobjetos dos veces con agua destilada durante 5 minutos.
13. Limpiar el agua alrededor de cada sección. Utilice un bolígrafo barrera hidrofóbica para rodear las secciones y soltar DAPI o solución de montaje anti-fade no fluorescente en el círculo. Coloque con cuidado por la hoja de la cubierta.

4. La tinción inmunohistoquímica para Runx2 y DMP1

NOTA: El aire IgGcontrol es necesario para la tinción inmunohistoquímica para evitar falsos positivos señales. La tinción de los grupos experimentales y de control necesita ser realizado simultáneamente.

1. Incubar los portaobjetos en una cámara de 37 ° C para eliminar el agua antes de la tinción.
2. Lavar los portaobjetos dos veces con agua destilada.
3. Utilice el lápiz barrera hidrofóbica que encuentre todos los tramos de la diapositiva. A partir de este paso, añadir toda la solución preparada en el círculo para cubrir completamente las secciones.
4. Tratar las secciones con hialuronidasa en una cámara húmeda a 37 ° C durante 30 min. El volumen de la solución (en pasos de 4,5 - 4,8) depende del tamaño de la sección. Utilice 50 l de solución para el cóndilo y 100 l para el hueso largo. Lavar con PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) tres veces.
5. Preparar y aplicar la solución de bloqueo a cada sección y se incuba en una cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente.
6. Se incuban las secciones con primariasolución de anticuerpo (Runx2 de conejo anti-ratón o de conejo anti-ratón DMP1) a 4 ° C durante la noche. Lavar con PBS tres veces.
7. Se incuban las secciones con solución de anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo, Alexa Fluor 488) durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con PBS tres veces.
8. Limpiar el agua alrededor de la sección y soltar DAPI en el círculo para cubrir la sección en la diapositiva. Coloque con cuidado por la hoja de la cubierta.

5. Microscopía Confocal

1. Captura de imágenes de células fluorescentes usando un microscopio confocal en longitudes de onda que van de 488 micras (verde) a 561 micras (rojo). Tomar varias imágenes apiladas a 200 Hz (dimensiones de 1.024 x 1.024) ¹⁹ utilizando 10X, 20X, 63X y lentes.

Resultados

Directamente condrocitos se transforman en células óseas (osteoblastos y osteocitos) en el cóndilo mandibular y hueso largo.

Aggrecan, un gen crítico para la condrogénesis, se expresa principalmente en los primeros y maduras condrocitos ^18. Como resultado, la inyección de tamoxifeno a las 2 semanas de edad en Agg-Cre ^ERT2; Ratones Rosa26 ^tdTomato

Discusión

Debido a las limitaciones tecnológicas, siempre es difícil de investigar el comportamiento de las células in vivo. Sin embargo, la técnica de rastreo de linaje celular está demostrando ser una herramienta poderosa para el estudio de la biología celular ^7-9. En este estudio, podemos mejorar aún más este protocolo mediante la combinación con inmunofluorescencia. De esta manera, el destino celular puede ser definido por múltiples marcadores relacionados, que amplía la aplicación de rastreo d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS