Co-локализация клеточных клонов Маркеры и томата Signal

Резюме

Мы разработали два набора трассировки комбинаций в Rosa26 ^tdtomato (экспрессируется во всех клетках) / Cre (специфически экспрессируется в хондроцитах) мышей: один с 2.3Col1a1-GFP (специфичными к остеобластов) и один с иммунофлюоресценции (специфичные для костных клеток). Полученные данные показывают, прямое превращение хондроцитов в костных клеток.

Аннотация

Система отслеживания клеточных клонов была использована главным образом в развитии исследований по биологии. Использование Cre рекомбиназой позволяет активацию репортера в определенной клеточной линии, и все потомство. Здесь мы использовали клеточную линию трассировку технику , чтобы продемонстрировать , что хондроциты непосредственно превращаются в остеобласты и остеоциты во время длинных трубчатых костей и развития нижней челюсти мыщелка с использованием двух видов Cre, Col10a1-Cre и агрекана-Cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2), скрещивают с Rosa26 ^tdTomato. Оба Col10 и аггрекан хорошо узнаваемым маркеры для хондроцитов.

Исходя из этого, мы разработали новый метод-клеточной линии трассировки в сочетании с флуоресцентной иммуногистохимии-клеток, чтобы определить судьбу путем анализа экспрессии специфических клеточных маркеров. Runx2 (маркер для остеогенных клеток на ранней стадии) и дентина матрица protein1 (DMP1, маркер для поздней стадии остеогенных клеток)используется для идентификации хондроцитов происхождения костных клеток и их состояние дифференцировки. Такое сочетание не только расширяет применение отслеживании клеточных клонов, но и упрощает генерацию сложных мышей. Что еще более важно, количество, расположение и дифференциации статусы родительской клетки потомстве отображаются одновременно, обеспечивая больше информации, чем клеточной линии отслеживания в одиночку. В заключение отметим , что совместное применение методов отслеживании клеточных клонов и иммунофлюоресценции является мощным инструментом для исследования клеточной биологии в естественных условиях.

Введение

В процессе разработки, формирование эндохондральной кости приходится более 80% от объема скелета. Широко распространено мнение о том, что она начинается с апоптозом гипертрофических хондроцитов. Затем клетки из нижележащего костного мозга вторжению и инициировать ангиогенез, с последующим новым отложение костной ткани за счет костной marrow- и надкостницы клеток , полученных в ^1,2 раза . Клетка судьба гипертрофированных хондроцитов (ГЦ), однако, был предметом споров в течение десятилетий ^3. Первоначально ГЦ считались конец хондроцитов пути дифференцировки и апоптоза обычно считается окончательная судьба ГЦ. Теперь, некоторые исследователи предполагают, что по крайней мере некоторые HCs могли бы выжить и способствовать формированию эндохондральной кости. Несмотря на то, что они предложили , чтобы рост пластины хондроциты имел возможность трансформироваться в остеобласты , основанные на ультраструктуры, иммуногистохимического окрашивания, и в пробирке не изучает ^46, ни один из этих методов шпрежде чем окончательное в демонстрации хондроцитов вклад в остеобластов линии.

Методика отслеживания клеточных клонов обеспечивает более строгий подход к изучению клеточной судьбы. Коротко говоря, рекомбиназа фермент, который экспрессируется только в определенном типе клеток, стимулирует экспрессию гена-репортера. Таким образом, этот тип клеток и их потомков постоянно помечены ^7. Система Cre-LoxP обычно используется в трассировке линии. Cre (рекомбиназа фермент) будет эксцизии последовательности , то между двумя LoxP сайтов и активировать репортер в специфической клеточной линии (рисунок 1А). В некоторых случаях исследователь может выбрать благоприятный момент времени , чтобы активировать Cre с помощью лекарственного средства, такие как тамоксифен, в результате чего Cre сплавить с измененной формой рецептора эстрогена (CRE ^{ERT2) 8.} Флуоресцентные репортеры стали стандартом в линии отслеживания экспериментов, поскольку они резко снижают сложностьи повысить точность и эффективность клеточной судьбы кальку ^8,9. tdTomato становится лучшим выбором среди флюоресцентных репортеров , поскольку она имеет самый яркий флуоресцентный белок и самый сильный эпифлуоресцентной, что делает его легко визуализировать ⁷ (рисунок 1А).

Используя родословие Rosa26 ^tdTomato трассировку системы, наша группа и другие исследователи показали , что ГЦ могут изменить свой фенотип в костных клеток в процессе развития ^10-14. Для достижения этой цели , мы разработали два набора отслеживании комбинации с Rosa26 ^tdtomato (повсеместного выражение во всех клетках) / Cre (специфичными к хондроцитов) мышей: 2.3Col1a1-GFP (специфичными к остеобластов) и иммунофлюоресценции (характерные для костных клеток). Полученные данные показывают , что оба метода являются жизнеспособными пути исследования клеточной судьбы в естественных условиях.

протокол

Все протоколы были рассмотрены и одобрены животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Texas A & M University College стоматологии по.

1. Животноводство

1. Используйте три модели животных в данном исследовании. Для того, чтобы исследовать судьбу эмбриональных хондроцитов в формировании мыщелка, сначала используйте Col10a1-CRE ¹⁵ мышей и скрестить их с Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Гт (РОСА) 26Sor ^{ТМ9 (CAG-tdTomato) Hze} / J) мышей для получения Col10a1- Cre и Rosa26 ^tdTomato мышей. Далее пересечь этих мышей с 2.3Col1a1, GFP мышей ^16. Используйте Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP мышей , чтобы выполнить трассировку клеточных клонов экспериментов (рис 1б).
2. Изучить судьбу послеродовых хондроцитов, следовать той же процедуре, что и в шаге 1.1, но использовать агрекана-CRE ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2) ^17,18 линия и держать Agg-Cre ^ERT2; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP мышей , чтобы выполнить трассировку клеточных клонов экспериментов (рис 1C). Вводят тамоксифен на постнатальный день 14.
3. Чтобы объединить клеточную линию трассировку технику с иммунофлуоресценции, крест мышей Agg-Cre ^ERT2 и мышей Rosa26 ^tdTomato. Используйте мышей , которые несут оба гена в эксперименте и впрыснуть тамоксифен на послеродовом 3 -й день (рис 1D).

2. Подготовка материала

1. Растворить тамоксифеном порошок в 10% этанола и 90% масла кукурузы при концентрации 10 мг / мл. Дозировка для инъекций 75 мг / кг.
2. Растворить порошок параформальдегида (PFA) в PBS до концентрации 4%, с использованием 2 М гидроокисью натрия, чтобы отрегулировать значение рН до 7,4. Используйте 4% раствора PFA для фиксации ткани (нижнечелюстной мыщелок и задние ноги используются здесь) после жертвы. Из-за еготоксичность, ручка PFA в капюшоне с перчатками и лицевую маску.
3. Растворить порошок EDTA в дистиллированной воде до концентрации 10%, с использованием 2 М гидроокисью натрия, чтобы отрегулировать значение рН до 7,4. Используйте 10% ЭДТА до декальцинировать нижнечелюстной мыщелок и заднюю ногу.
4. Растворить порошок сахарозы в PBS при концентрациях 15% и 30%. Используйте раствор сахарозы обезвоживает ткани после того, как декальцинации.
5. Растворить порошок гиалуронидазы в PBS при концентрации 2 мг / мл, рН 5,0. Это решение предназначено для извлечения иммунофлюоресценции антигена.
6. С помощью 1,5-мл пробирку с получением раствора блокирующего, содержащего 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 20% сыворотки козьего в PBS для Runx2 или DMP1 специфического окрашивания.
7. С помощью 1,5-мл пробирку, чтобы получить раствор первичного антитела, содержащего 2% сыворотки козьего в PBS для Runx2 или DMP1 специфического окрашивания. Концентрация первичного антитела составляет 1: 400 для Runx2 и 1: 100 для DMP1.
8. Используйте 1,5-мл пробирку для подготовкиIgG кролика раствор в качестве контроля для иммунофлуоресцентного окрашивания, чтобы избежать ложных положительных результатов. Раствор содержит 2% сыворотки козьего в PBS. Концентрацию кроличьего IgG для контроля Runx2 составляет 1: 400; для DMP1, 1: 100. Выполнение эксперимента и контроля окрашивания одновременно.
9. Используйте 1,5 мл пробирку, чтобы приготовить вторичный раствор антител, содержащий 2% сыворотки козьего в PBS для Runx2 или DMP1 иммунофлуоресцентного окрашивания. С помощью вторичного антитела в разведении 1: 500.

3. Задвиньте Подготовка к конфокальной микроскопии (Cell Lineage Tracing Только Нет Комбинация с иммунофлуоресценции)

1. Вводят тамоксифен в CRE-Agg ^ERT2 мышей при благоприятном момент времени.
   1. Во-первых, удалить мышь из клетки. Затем, используя большой палец левой руки и указательный палец, чтобы захватить кожу на спине мыши и перевернуть его, обнажив живот. Используйте правую руку, чтобы удерживать шприц. Оптимальная точка входа для инъекций на лEFT или с правой стороны нижней части живота, избегая печени и мочевого пузыря.
   2. Держите шприц параллельно задних ног мыши и вводят внутрибрюшинно. Дозировка для инъекций 75 мг / кг. Веса мышей в возрасте от 2-х недель, 3 недели и 4 недели примерно 7 - 9 г, 11 - 13 г, и 16 - 18 г, соответственно.
2. Обезболить мышей с комбинацией Ксилазин / Ketaset.
   1. Для приготовления рабочего раствора, сначала разбавить ксилазина и Ketaset дистиллированной водой до концентрации 1 мг / мл и 5 мг / мл, соответственно. Затем смешать ксилазина и Ketaset в соотношении 1: 2. Дозировка для инъекций составляет 30 мкл / г.
   2. Вводите как на этапе 3.1. Подтвердите обезболивание, зажимая лодыжку мыши. Мышь находится в бессознательном, если он не имеет никакой реакции.
3. Заливать мышей с 4% PFA после обезболиванием.
   1. После того, как мышь теряет сознание, фиксируют четыре ноги мыши на борту entirelу обнажить живот.
   2. Пропитайте живота с 70% этанола и произвести вырезание из нижней части живота к шее вдоль средней линии. Pinch и одновременно потяните кожу на боковых сторонах, чтобы выявить брюшину. Используйте рассечение ножницами, чтобы сделать продольное иссечение.
   3. Отрежьте и снимите передние ребра, чтобы обнажить сердце. Прокол сердца от левого желудочка с 22 G шприца, держать шприц, и одновременно сократить слот в правом предсердии.
   4. Медленно вводят 4% PFA, который перфузию вдоль сердечно-сосудистой системы в то время как кровь смывает из разреза из правого предсердия. Объем PFA для перфузией составляет 1 мл / г. Выполните этот шаг в шкафу класса I по биологической безопасности, который с трудом вентиляционным каналом здание системы выпуска отработавших газов.
4. Снимают кожу мыши и поместить все тело в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку, которая содержит 40 мл 4% PFA зафиксировать в течение ночи при температуре 4 ° С.
5. Используйте рассечение ножницами и # 3 и # 5 щипцов тщательно удалить нижнюю челюсть и заднюю ногу от тела и удаления мышц и сухожилий на поверхности. Выполните этот шаг в шкафу класса I по биологической безопасности, который с трудом вентиляционным каналом здание системы выпуска отработавших газов.
6. Обрежьте нижнюю челюсть на две части в дистальной области третьего моляра. Точно так же, срезанные бедренной и большеберцовой костей в диафиза подвергать полость костного мозга с целью ускорения декальцификацию. Помещенный часть, которая включает в себя процесс мыщелка и мыщелкового и вместе с задней ноги на 40-мл 10% -ного EDTA до накипь при 4 ° С в течение 2 - 4 дней в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку.
7. С помощью 50 мл 15% сахарозы в обезвоживают мыщелка и заднюю ногу в течение ночи при температуре 4 ° С в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку.
8. Используйте 30% сахарозы к обезвоживанию мыщелка и заднюю ногу в течение ночи при температуре 4 ° С в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку.
9. Вдоль сагиттальной плоскости, встраивать образца сОктябре на режущую пластину в cryosection машине.
   1. Горизонтально лежал мыщелка или заднюю ногу в монтажной формы. Погрузите ткань в ОСТ и оставить его в cryosection машине, пока не замерзнет октября.
   2. Установите блок ОКТ на режущей пластине. Подождите примерно 15 минут прежде, чем порезать, чтобы гарантировать, что ОКТ полностью заморожены.
10. Обрежьте мыщелок и заднюю ногу на секции 10 мкм. Соберите разделы на слайдах и хранить при температуре -20 ° C.
11. Выдержите слайд в камере C 37 °, чтобы удалить воду перед окрашиванием.
12. Промыть слайдов дважды дистиллированной водой в течение 5 мин,
13. Вытрите воду вокруг каждой секции. Используйте гидрофобный барьер пера круг секций и падение DAPI или не-флуоресцирующий анти-выцветанию решение для монтажа в круг. Аккуратно сложить покровное.

4. Иммуногистохимическое Окрашивание для Runx2 и DMP1

ПРИМЕЧАНИЕ: IgG противТроль необходимо для иммуногистохимического окрашивания, чтобы избежать ложных положительных сигналов. Окрашивание для экспериментальной и контрольной групп должна выполняться одновременно.

1. Инкубируйте слайдов в камере C 37 °, чтобы удалить воду перед окрашиванием.
2. Вымойте слайды дважды дистиллированной водой.
3. Используйте гидрофобный барьер пера обвести все разделы на слайде. От этого шага, добавьте все приготовленного раствора в круг, чтобы полностью покрыть секции.
4. Treat участки с гиалуронидаза во влажной камере при 37 ° С в течение 30 мин. Объем раствора (в шагах 4.5 - 4.8), зависит от размера участка. Используйте 50 мкл раствора для мыщелка и 100 мкл для длинных трубчатых костей. Промыть PBST (PBS, содержащем 0,1% Tween 20) три раза.
5. Подготовить и применить блокирующий раствор для каждой секции и инкубировать их во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Инкубируйте участки с первичнымРаствор антитела (кроличьи антитела мыши Runx2, или кроличье анти-мышь DMP1) при 4 ° С в течение ночи. Промывают ЗФР три раза.
7. Инкубируйте участки с раствором вторичными антителами (козий анти-кроличий, Alexa Fluor 488) в течение 2 ч при комнатной температуре. Промывают ЗФР три раза.
8. Вытрите воду вокруг секции и падение DAPI в круг, чтобы покрыть раздел на слайде. Аккуратно сложить покровное.

5. конфокальной микроскопии

1. Захват флуоресцентные изображения клеток с помощью конфокальной микроскопии в диапазоне длин волн от 488 мкм (зеленый) до 561 мкм (красный). Возьмите несколько сложенных изображения с частотой 200 Гц (размеры 1,024 × 1,024) ¹⁹ с использованием 10X, 20X и 63X линзы.

Результаты

Chondrocytes Непосредственно Превращение в костные клетки (остеобласты и остеоциты) в нижнечелюстной мыщелок и длинных трубчатых костей.

Агрекана, критический ген хондрогенезе, в основном выражается в ранних и зрелых хондроц...

Обсуждение

Из - за технических ограничений, всегда трудно исследовать поведение клеток в живом организме . Тем не менее, метод трассировки клеточных клонов, оказывается мощным инструментом для изучения клеточной биологии ^7-9. В данном исследовании мы улучшить этот протокол путем объеди?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS