Co-localisation des marqueurs de cellules de la lignée et le signal de tomate

Résumé

Nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons dans Rosa26 ^tdTomato (ubiquitaire exprimé dans toutes les cellules) / Cre (spécifiquement exprimé dans les chondrocytes) souris: une avec 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et une avec immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent la transformation directe des chondrocytes dans les cellules osseuses.

Résumé

Le système de traçage de la lignée cellulaire a été utilisé principalement dans les études de biologie du développement. L'utilisation de la recombinase Cre permet l'activation du rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique et toute la descendance. Ici, nous avons utilisé la lignée cellulaire de traçage technique pour démontrer que les chondrocytes transforment directement en ostéoblastes et ostéocytes pendant os long et le développement de condyle mandibulaire en utilisant deux types de Cre, Col10a1-Cre et Aggrecan-Cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2), traversé avec Rosa26 ^tdTomato. Les deux col10 et aggrécane sont des marqueurs bien reconnus pour chondrocytes.

Sur cette base, nous avons développé une nouvelle lignée méthode cellules traçage en conjonction avec fluorescent cellule sort immunohistochimie à définir en analysant l'expression de marqueurs cellulaires spécifiques. Runx2 (un marqueur pour les cellules ostéogéniques stade précoce) et la dentine matrice protein1 (DMP1; un marqueur pour les cellules ostéogéniques en fin de ligne) étaientutilisé pour identifier les cellules osseuses chondrocytes dérivés et leur état de différenciation. Cette combinaison non seulement élargit l'application de la lignée cellulaire traçage, mais simplifie également la génération de souris composés. Plus important encore, les statuts nombre, l'emplacement et la différenciation des descendants de la cellule mère sont affichées simultanément, fournissant plus d'informations que la lignée cellulaire de traçage seul. En conclusion, la co-application de la lignée cellulaire techniques de traçage et immunofluorescence est un outil puissant pour étudier la biologie des cellules in vivo.

Introduction

Pendant le développement, la formation osseuse endochondrale représente plus de 80% du volume du squelette. Il est largement admis qu'il commence par l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques. Ensuite, les cellules de la moelle osseuse sous - jacente envahir et d' initier une angiogenèse, suivie par le dépôt osseux nouveau par marrow- osseuse et les cellules dérivées de ^1,2 périoste. Le destin cellulaire de chondrocytes hypertrophiques (HCS), cependant, a été un sujet de débat depuis des décennies ^3. Dans un premier temps, CAH ont été considérés comme la fin de la voie de la différenciation des chondrocytes, et l'apoptose a été généralement considérées comme le sort ultime de CAH. Maintenant, certains chercheurs suggèrent qu'au moins certains CAH pourraient survivre et contribuer à la formation d'os endochondral. Bien qu'ils ont proposé que la croissance des chondrocytes de la plaque avaient la capacité de transdifférencier en ostéoblastes basé sur ultrastructure, la coloration immunohistochimique, et des études in vitro ^46, aucune de ces méthodes wERE définitive à démontrer la contribution des chondrocytes à la lignée des ostéoblastes.

La technique lignée cellulaire de traçage fournit une manière plus rigoureuse pour étudier le destin des cellules. Brièvement parlant, une enzyme recombinase, ce qui est exprimé uniquement dans un type particulier de cellules, stimule l'expression du gène rapporteur. De cette façon, ce type de cellule et leurs descendants sont marqués de façon permanente ^7. Le système Cre-loxP est couramment utilisé dans la lignée de traçage. Cre (l'enzyme recombinase) excise la séquence d'arrêt entre les deux sites loxP et activer le rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique (figure 1A). Dans certains cas, l'enquêteur peut choisir un point de temps favorable pour activer Cre en utilisant un médicament, comme le tamoxifène, causant Cre à fusionner à une forme modifiée du récepteur des oestrogènes (Cre ^{ERT2) 8.} reporters fluorescents sont devenus la norme dans la lignée de traçage des expériences, car ils réduisent considérablement la complexitéet d' améliorer la précision et l' efficacité du destin cellulaire traçage ^8,9. tdTomato devient le meilleur choix parmi les reporters fluorescents , car il a la plus brillante protéine fluorescente et l'épifluorescence plus forte, ce qui rend facilement visualisées ⁷ (figure 1A).

En utilisant la lignée Rosa26 ^tdTomato système de traçage, notre groupe et d' autres chercheurs ont montré que CAH peut changer leur phénotype des cellules osseuses au cours du développement ^10-14. Pour ce faire , nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons avec Rosa26 ^tdTomato (expression omniprésente dans toutes les cellules) / Cre (spécifique à chondrocytes) souris: 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent que les deux méthodes sont des moyens viables pour étudier le destin des cellules in vivo.

Protocole

Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) au Texas A & M University College of Dentistry.

Elevage 1. Animal

1. Utiliser trois modèles animaux dans cette étude. Pour enquêter sur le sort des chondrocytes embryonnaires dans la formation de condyle, la première utilisation Col10a1-Cre ¹⁵ souris et les croiser avec Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{TM9 (CAG-tdTomato) Hze} / J) souris pour obtenir Col10a1- souris Cre et Rosa26 ^tdTomato. Ensuite, traverser ces souris avec 2.3Col1a1-GFP souris ^16. Utilisez Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; Souris 2.3Col1a1-GFP pour réaliser les expériences lignée cellulaire de traçage (figure 1B).
2. Pour étudier le sort des chondrocytes postnatales, suivez la même procédure que dans l' étape 1.1, mais utiliser le ^ERT2 Aggrecan-cre (Agg-Cre ^ERT2) ^17,18 ligne et de garder le Agg-Cre ^ERT2; Rosa26 ^tdTomato; Souris 2.3Col1a1-GFP pour réaliser les expériences lignée cellulaire de traçage (figure 1c). Injecter tamoxifène le jour postnatal 14.
3. Pour combiner la lignée cellulaire de traçage technique avec immunofluorescence, traverser souris Agg-Cre ^ERT2 et souris Rosa26 ^tdTomato. Utiliser des souris qui portent les deux gènes dans l'expérience et injecter le tamoxifène le jour postnatal 3 (figure 1D).

2. Préparation du matériel

1. Dissoudre la poudre tamoxifène dans 10% d'éthanol et l'huile de maïs à 90% à une concentration de 10 mg / ml. La posologie pour l'injection est de 75 mg / kg.
2. Dissoudre la poudre de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS à une concentration de 4%, en utilisant 2 M d'hydrate de sodium pour ajuster la valeur du pH à 7,4. Utiliser une solution PFA 4% pour fixer le tissu (le condyle mandibulaire et patte arrière sont utilisés ici) après le sacrifice. En raison de sala toxicité, la poignée PFA dans le capot avec des gants et un masque facial.
3. Dissoudre la poudre d'EDTA dans de l'eau distillée à une concentration de 10%, en utilisant 2 M d'hydrate de sodium pour ajuster la valeur du pH à 7,4. Utiliser 10% d'EDTA pour détartrer le condyle mandibulaire et patte arrière.
4. Dissoudre la poudre de saccharose dans du PBS à des concentrations de 15% et 30%. Utilisez la solution de saccharose à déshydrater le tissu après décalcification.
5. Dissoudre la poudre de hyaluronidase dans du PBS à une concentration de 2 mg / ml, pH 5,0. Cette solution est pour la récupération de l'antigène immunofluorescence.
6. Utiliser un tube de 1,5 ml pour préparer une solution de blocage contenant 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et du sérum de chèvre à 20% dans du PBS pendant Runx2 ou DMP1 coloration immunofluorescente.
7. Utiliser un tube de 1,5 ml pour préparer une solution d'anticorps primaire contenant du sérum de chèvre à 2% dans du PBS pendant Runx2 ou DMP1 coloration immunofluorescente. La concentration de l'anticorps primaire est de 1: 400 pour Runx2 et 1: 100 pour DMP1.
8. Utilisez un tube de 1,5 ml pour préparerla solution IgG de lapin comme témoin pour immunofluorescence afin d'éviter des résultats faussement positifs. La solution contient de 2% de sérum de chèvre dans du PBS. La concentration de l'IgG de lapin pour le contrôle de Runx2 est de 1: 400; pour DMP1, 1: 100. Effectuer l'expérience et le contrôle coloration simultanément.
9. Utiliser un tube de 1,5 ml pour préparer une solution d'anticorps secondaire contenant du sérum de chèvre à 2% dans du PBS pendant Runx2 ou DMP1 coloration immunofluorescente. Utiliser l'anticorps secondaire à une dilution de 1: 500.

3. Préparation de la lame pour microscopie confocale (Cell Lineage Tracing seulement, aucune combinaison avec immunofluorescence)

1. Injecter tamoxifène dans le-cre Agg ^ERT2 souris à un point de temps favorable.
   1. D'abord, enlever une souris de sa cage. Ensuite, utilisez le pouce et l'index gauche pour saisir la peau sur le dos de la souris et retournez-le, exposant l'abdomen. Utilisez la main droite pour tenir la seringue. Le point d'entrée optimal pour l'injection est sur la lauche ou sur le côté droit de hypogastre, en évitant le foie et de la vessie.
   2. Conserver la seringue parallèlement aux pattes postérieures de la souris et injecter par voie intrapéritonéale. La posologie pour l'injection est de 75 mg / kg. Les poids des souris à l'âge de 2 semaines, 3 semaines et 4 semaines d'âge sont d'environ 7-9 g, 11 - 13 g et de 16 - 18 g, respectivement.
2. Anesthésier la souris avec une combinaison xylazine / Ketaset.
   1. Pour préparer la solution de travail, tout d'abord diluer la xylazine et Ketaset avec de l'eau distillée à une concentration de 1 mg / ml et 5 mg / ml, respectivement. Ensuite, mélanger le Xylazine et Ketaset dans un rapport 1: 2. La posologie pour l'injection est de 30 ul / g.
   2. Injecter comme dans l'étape 3.1. Confirmez le anesthetization en pinçant la cheville de la souris. La souris est inconsciente si elle n'a pas de réaction.
3. Perfuser les souris avec 4% PFA après anesthésie.
   1. Après la souris perd conscience, fixer les quatre pieds de la souris sur une planche à entirely exposer l'abdomen.
   2. Saturer l'abdomen avec 70% d'éthanol et faire une excision de l'abdomen inférieur au cou le long de la ligne médiane. Pincez et simultanément tirer la peau sur les côtés latéraux pour révéler la membrane péritonéale. Utilisez des ciseaux de dissection pour faire une excision longitudinale.
   3. Couper et retirer les côtes avant d'exposer le coeur. Percer le cœur du ventricule gauche avec un 22 G seringue, tenez la seringue, et simultanément couper une fente dans l'oreillette droite.
   4. Lentement injecter 4% PFA, qui est perfusé le long du système cardio-vasculaire, tandis que les bouffées de sang sur la coupe de l'oreillette droite. Le volume de la PFA pour la perfusion est de 1 ml / gramme. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique de classe I qui est dur canalisé vers le système d'évacuation du bâtiment.
4. Décollez la peau de la souris et de mettre le corps entier dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 ml contenant 40 ml de 4% PFA pour fixer une nuit à 4 ° C.
5. Utilisez des ciseaux de dissection et # 3 et # 5 forceps pour retirer soigneusement la mandibule et la patte arrière du corps et de supprimer les muscles et les tendons sur la surface. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique de classe I qui est dur canalisé vers le système d'évacuation du bâtiment.
6. Couper la mandibule en deux morceaux à la région distale de la troisième molaire. De même, couper le fémur et le tibia dans les midshaft pour exposer la cavité de la moelle osseuse afin d'accélérer la décalcification. Mettez la partie qui comprend le processus de condyle et condyle et le long de la patte arrière dans 40 ml de 10% d'EDTA à détartrer à 4 ° C pendant 2 - 4 jours dans un tube en polypropylène centrifugeuse de 50 ml.
7. Utiliser 50 ml de 15% de saccharose pour déshydrater le condyle et la patte arrière pendant une nuit à 4 ° C dans un tube de centrifugeuse de polypropylene de 50 ml.
8. En utilisant 30% de saccharose pour déshydrater le condyle et la patte arrière pendant une nuit à 4 ° C dans un tube de centrifugeuse de polypropylene de 50 ml.
9. Le long du plan sagittal, il faut insérer l'échantillon avecOctobre sur la plaque de coupe dans la machine à cryosection.
   1. Horizontalement jeter les condyle ou la patte arrière dans le moule de montage. Immerger le tissu dans l'OCT et le laisser dans la machine cryosection jusqu'à l'OPO se fige.
   2. Monter le bloc octobre sur la plaque de coupe. Attendez environ 15 minutes avant de couper pour faire en sorte que l'OPO est complètement gelé.
10. Couper le condyle et la patte arrière en sections de 10 um. Collecter les sections sur des lames et conserver à -20 ° C.
11. Incuber la lame dans une chambre C de 37 ° pour éliminer l'eau avant la coloration.
12. Laver les lames deux fois avec de l'eau distillée pendant 5 min.
13. Essuyez l'eau autour de chaque section. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler les sections et déposez DAPI ou d'une solution de montage anti-fade non fluorescent dans le cercle. déposer doucement sur la lamelle.

4. Coloration immunohistochimique pour Runx2 et DMP1

NOTE: Le con IgGcontrôle est nécessaire pour une coloration immunohistochimique pour éviter des signaux faux positifs. La coloration pour les groupes expérimentaux et de contrôle doit être exécuté simultanément.

1. Incuber les lames dans une chambre C de 37 ° pour éliminer l'eau avant la coloration.
2. Laver les lames deux fois avec de l'eau distillée.
3. Utilisez le stylo barrière hydrophobe pour entourer toutes les sections sur la diapositive. A partir de cette étape, ajouter la totalité de la solution préparée dans le cercle pour couvrir complètement les sections.
4. Traiter les sections avec de la hyaluronidase dans une chambre humide à 37 ° C pendant 30 min. Le volume de la solution (dans les étapes 4.5 - 4.8) dépend de la taille de la section. Utilisez 50 pi de solution pour le condyle et 100 pi pour l'os long. Laver avec du PBST (PBS contenant 0,1% de Tween 20) trois fois.
5. Préparer et appliquer la solution de blocage à chaque section et de les incuber dans une chambre humide pendant 1 heure à température ambiante.
6. Incuber les sections avec primaireune solution d'anticorps (Runx2 de lapin anti-souris ou un lapin anti-souris DMP1) à 4 ° C pendant une nuit. Laver avec du PBS trois fois.
7. Incuber les sections avec une solution d'anticorps secondaire (chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488) pendant 2 heures à la température ambiante. Laver avec du PBS trois fois.
8. Essuyez l'eau autour de la section et déposez DAPI dans le cercle pour couvrir la section sur la diapositive. déposer doucement sur la lamelle.

5. Microscopie confocale

1. Capturer des images de cellules à fluorescence en utilisant un microscope confocal à des longueurs d'onde allant de 488 um (vert) à 561 um (rouge). Prendre plusieurs images empilées à 200 Hz (dimensions de 1,024 × 1,024) ¹⁹ en utilisant 10X, 20X et 63X lentilles.

Résultats

Chondrocytes Transform directement dans les cellules osseuses (ostéoblastes et ostéocytes) dans le mandibulaire condyle et Long Bone.

Aggrécane, un gène essentiel pour la chondrogenèse, est principalement exprimé dans les chondrocytes matures précoces et ^18. Par conséquent, l'injection de tamoxifène à 2 semaines d'âge dans Agg ^ERT2-Cre;

Discussion

En raison des limites technologiques, il est toujours difficile d'enquêter sur le comportement des cellules in vivo. Cependant, la technique lignée cellulaire de traçage se révèle être un outil puissant pour étudier la biologie des cellules ^7-9. Dans cette étude, nous améliorons encore ce protocole en le combinant avec immunofluorescence. De cette façon, le destin des cellules peut être défini par plusieurs marqueurs associés, ce qui élargit l'application de la lignée de traça...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS