細胞系譜マーカーの共局在とトマト信号

要約

2.3Col1a1-GFP（骨芽細胞に特異的）で1と（骨細胞に特異的）免疫蛍光との1：私たちは（特に軟骨細胞で発現さ）/のCreマウス（遍在すべての細胞で発現）Rosa26遺伝子^tdtomatoのトレースの組み合わせの2セットを開発しました。データは、骨細胞への軟骨細胞の直接形質転換を実証します。

要約

細胞系統追跡システムは、発生生物学研究に主に使用されてきました。 Creリコンビナーゼの使用は、特定の細胞株およびすべての子孫におけるレポーターの活性化を可能にします。ここでは、軟骨細胞は、直接のCre、Col10a1-のCreおよびアグリカン-Creを^ERT2（ のAgg-Creを^ERT2）の2種類を使用して、長い骨と下顎頭の開発中に骨芽細胞および骨細胞に変身することを実証するための技術をトレースする細胞系譜を使用し、Rosa26遺伝子と交配^tdTomato。 Col10とアグリカンの両方が軟骨細胞のためのマーカーをよく認識しています。

これに基づき、我々は、蛍光免疫組織化学-する特定の細胞マーカーの発現を分析することによって、細胞の運命を定義すると併せてトレース新しい方法細胞系統を開発しました。 Runx2の（早期骨形成細胞のマーカー）および象牙質マトリックスprotein1（DMP1;後期骨形成細胞のマーカー）しました。軟骨細胞由来の骨細胞およびそれらの分化状態を識別するために使用されます。この組み合わせは、細胞系統のトレースの適用を広げるだけでなく、化合物をマウスの生成を簡素化するだけでなく。さらに重要なことは、親細胞の子孫の数、位置、および分化の状態だけではトレース細胞系統よりも多くの情報を提供し、同時に表示されます。結論として、細胞系譜トレース技術および免疫蛍光の同時適用は、in vivoで細胞生物学を研究するための強力なツールです。

概要

開発中に、軟骨内骨形成は、骨格の体積の80％以上を占めています。広く、それが肥大軟骨細胞のアポトーシスから始まると考えられています。続いて、下層の骨髄由来の細胞が侵入し、骨髄および骨膜由来の細胞^1,2による新たな骨沈着に続いて血管新生を、開始します。肥大軟骨細胞（HCS）の細胞の運命は、しかし、数十年の³のための議論の課題となっています。最初に、のHCは、軟骨細胞分化経路の末端であるとみなされ、アポトーシスは、一般のHCの最終的な運命であると考えられました。今、一部の研究者は、少なくとも一部のHCが生き残ると軟骨内骨形成に寄与し得ることを示唆しています。彼らは成長板軟骨細胞は、超微細構造に基づいて、骨芽細胞に分化転換する能力、免疫組織化学染色を持っていたし、in vitroで 、これらの方法のいずれもが、ワット^、46を研究^することを提案したが、骨芽細胞系への軟骨細胞の寄与を実証するに決定的なERE。

細胞系譜トレース技術は、細胞の運命を研究するためのより厳密な方法を提供します。簡単に言えば、唯一の細胞の特定の型で表現されるリコンビナーゼ酵素は、レポーター遺伝子の発現を刺激します。このように、この細胞の種類とその子孫は永久に^7のラベル^が付いてい^ます 。 Cre-loxP系は、一般に系統追跡に使用されます。 CRE（リコンビナーゼ酵素）は、2つのloxP部位の間にSTOPシーケンスを切除し、特定の細胞株（ 図1A）でレポーターを活性化します。いくつかのケースでは、研究者は、Creは、エストロゲン受容体（Creを^ERT2）8の修正された形に融合させ、タモキシフェンなど、薬剤を使用してのCreを活性化するために有利な時点を選択することができます。蛍光レポーターは、彼らが劇的に複雑さを軽減するための実験をトレースする系統における標準となっていますそして^、8,9をトレース細胞の運命の精度と効率を向上させます。それはそれは簡単に^7（ 図1A）を可視化すること、明るい蛍光タンパク質と最強のエピ蛍光を有しているためtdTomatoは、蛍光レポーターの中で最良の選択となってきています。

トレースシステムのRosa26 ^{tdTomato系統}を使用することにより、当社グループおよび他の研究者は、HCSは、開発^10-14の間に骨細胞へのそれらの表現型を変更することができることを示しています。これを達成するために、我々は、Rosa26遺伝子^tdtomato（全ての細胞中に遍在式）/のCre（軟骨細胞に特異的な）マウスとの組み合わせを追跡する二組の開発：2.3Col1a1-GFP（骨芽細胞に特異的）および免疫蛍光（骨細胞に特異的）。データは、両方の方法は、 インビボでの細胞の運命を研究するための実行可能な方法であることを示しています。

プロトコル

すべてのプロトコルは、歯科のテキサスA＆M大学で施設内動物管理使用委員会（IACUC）によってレビューされ、承認されました。

1.動物の繁殖

1. 本研究では3動物モデルを使用してください。顆形成に胚の軟骨細胞の運命を調査し、最初の使用Col10a1-Creを ¹⁵匹とのRosa26 ^tdTomatoでそれらを横断するには（B6; 129S6- Gtの（ROSA）26Sor ^{TM9（CAG-tdTomato）Hze} / J）マウスはCol10a1-を得るために、 CREとのRosa26 ^tdTomatoマウス。次に、2.3Col1a1-GFPマウス ¹⁶と、これらのマウスを渡ります。 Col10a1-Creをを使用します。 ROSA26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFPマウスは、細胞系譜トレース実験（ 図1B）を実行します。
2. 出生後軟骨細胞の運命を研究するために、ステップ1.1と同様の手順に従いますが、 アグリカン-CREの^ERT2（ のAgg-Creを^ERT2を使用^）17,18ラインとのAgg-Creを^ERT2を保ちます。 ROSA26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFPマウスは、細胞系譜トレース実験（ 図1C）を実行します。生後14日目にタモキシフェンを注入します。
3. 免疫蛍光と技術をトレースする細胞系譜を結合するには、 のAgg-Creを^{ERT2マウス}とのRosa26 ^{tdTomatoマウス}を渡ります。実験で両方の遺伝子を運ぶマウスを使用し、生後3日目（ 図1D）にタモキシフェンを注入。

2.材料の準備

1. 10mg / mlの濃度で10％エタノールおよび90％のトウモロコシ油中タモキシフェン粉末を溶解します。注射のための投与量は75ミリグラム/ kgです。
2. 7.4のpH値を調整するために2 M水酸化ナトリウムを使用して、4％の濃度にPBS中パラホルムアルデヒド（PFA）粉末を溶解します。屠殺後（下顎頭と後ろ足がここで使用されている）は、組織を固定するために、4％PFAのソリューションを使用してください。理由は、そのの毒性は、手袋、フェイスマスクとフードにPFAを扱います。
3. 7.4のpH値を調整するために2 M水酸化ナトリウムを使用して、10％の濃度になるように蒸留水にEDTA粉末を溶解します。下顎頭と後肢を脱灰するために10％のEDTAを使用してください。
4. 15％および30％の濃度で、PBS中のスクロース粉末を溶解します。脱灰後の組織を脱水するためにショ糖溶液を使用してください。
5. 2 mg / mlで、pHが5.0の濃度でPBS中のヒアルロニダーゼの粉末を溶かします。このソリューションは、免疫抗原回復のためのものです。
6. Runx2のまたはDMP1免疫蛍光染色のためにPBS中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）、20％ヤギ血清を含有するブロッキング溶液を調製し、1.5 mlのチューブを使用します。
7. Runx2のかDMP1免疫蛍光染色のために、PBS中の2％ヤギ血清が含まれている一次抗体溶液を準備するために1.5 mlチューブを使用してください。 Runx2のための400および1：100 DMP1のための一次抗体の濃度が1です。
8. 準備するために1.5 mlチューブを使用します偽陽性の結果を回避するために、免疫蛍光染色のための対照としてのウサギIgG溶液。液をPBS中の2％ヤギ血清が含まれています。 Runx2の制御のためのウサギIgGの濃度は1：400; DMP1は、1：100。同時に実験およびコントロール染色を実行します。
9. Runx2のまたはDMP1免疫蛍光染色のためにPBS中の2％ヤギ血清を含有する二次抗体溶液を調製する1.5mlチューブを使用します。 500：1の希釈で二次抗体を使用してください。

3.スライドさせて共焦点顕微鏡のための準備（のみトレース細胞系統、免疫蛍光ではありませんコンビネーション）

1. 有利な時点でのAgg-CRE ^ERT2マウスではタモキシフェンを注入します。
   1. まず、そのケージからマウスを削除します。その後、腹部を露出させ、マウスの背中の皮膚を取得し、それをひっくり返すために左手の親指と人差し指を使用しています。シリンジを保持するために右手を使用してください。注射のための最適なエントリー・ポイントはリットルでありますEFTや下腹部の右側に、肝臓や膀胱を回避することができます。
   2. マウスの後肢に注射器を平行に保ち、腹腔内に注入します。注射のための投与量は75ミリグラム/ kgです。それぞれ、18グラム - 9グラム、11 - - 13グラム、および16の2週間、3週間、および4週齢の年齢のマウスの重量は約7です。
2. キシラジン/ Ketasetの組み合わせでマウスを麻酔。
   1. 作業溶液を調製するには、まず、それぞれ、1mg / mlのおよび5mg / mlの濃度に蒸留水でキシラジンとKetasetを希釈します。 2比：次に、1でキシラジンとKetasetを混ぜます。注射のための投与量は30μL/ gです。
   2. ステップ3.1のように注入します。マウスの足首をつまんで麻酔を確認してください。それは何の反応を持っていない場合は、マウスは無意識です。
3. 麻酔した後、4％PFAでマウスを灌流。
   1. マウスは意識を失った後、entirelするボード上でマウスの4脚を固定しますyは腹部を露出させます。
   2. 70％エタノールで腹部を飽和させ、中央の線に沿って首に下腹部から切除を行います。ピンチと同時に腹膜を明らかにするために側面に皮膚を引っ張ります。縦方向の切除を行うために解剖ハサミを使用してください。
   3. カットオフと心臓を露出するためにフロントリブを削除します。 、22 Gシリンジで左心室から心臓に穴を開け、シリンジを保持し、同時に右心耳にスロットを切りました。
   4. ゆっくりと右心耳からのカットから血液をフラッシュしながら、心血管系に沿って灌流される4％PFAを、注入します。灌流のためのPFAの体積を1ml /グラムです。ハードダクト建物の排気システムにあるクラスI生物学的安全キャビネットの中で、この手順を実行します。
4. ピールマウスの皮膚を切り、4℃で一晩固定するための4％PFAの40ミリリットルが含まれている50-mlのポリプロピレン製遠心管に全身を置きます。
5. 慎重に身体から下顎骨と後肢を除去し、表面に筋肉や腱を除去するために、解剖ハサミと＃3、＃5鉗子を使用してください。ハードダクト建物の排気システムにあるクラスI生物学的安全キャビネットの中で、この手順を実行します。
6. 第三大臼歯の先端領域で、2枚に下顎をカット。同様に、脱灰を促進するために、骨髄腔を露出させるために中間シャフトに大腿骨および脛骨を切断します。顆と関節丘処理を含む部分を入れて、10％のEDTAの40ミリリットルに後ろ足と一緒に2、4℃で脱灰するために - 50-mlのポリプロピレン遠心管中で4日間。
7. 50mlのポリプロピレン遠心管中で4℃で一晩顆と後肢を脱水し、15％ショ糖の50ミリリットルを使用してください。
8. 50mlのポリプロピレン遠心管中で4℃で一晩顆と後肢を脱水し、30％ショ糖を使用してください。
9. 矢状面に沿って、で試料を埋め込みます凍結切片機で切削プレート上の10月
   1. 水平顆またはマウント型内の後ろ足を置きます。 10月に組織を水没し、10月がフリーズするまで凍結切片機にそれを残します。
   2. 切削プレート上で10月ブロックをマウントします。 10月は完全に凍結されていることを確実にするために切断する前に、約15分間待ちます。
10. 10-μmの切片に顆と後肢をカットします。 -20℃でスライドや店舗のセクションを収集します。
11. 染色の前に水を除去するために、37℃の室内でスライドをインキュベートします。
12. 5分間蒸留水で2回スライドを洗浄します。
13. 各セクションの周りに水を拭き取り。セクションを一周し、円形にDAPIまたは非蛍光退色防止マウントソリューションを削除するには、疎水性のバリアペンを使用してください。慎重にカバースリップを置きます。

Runx2のとDMP1 4.免疫組織化学染色

注：IgGのコン免疫組織化学染色は、偽陽性シグナルを回避するトロールが必要です。実験群および対照群についての染色を同時に行う必要があります。

1. 染色の前に水を除去するために37℃のチャンバー内でスライドをインキュベートします。
2. 蒸留水で2回スライドを洗浄します。
3. スライド上のすべてのセクションを一周する疎水性バリアペンを使用してください。この段階から、完全にセクションをカバーするために円形に調製した溶液のすべてを追加します。
4. 37℃で30分間加湿チャンバー内にヒアルロニダーゼを持つセクションを扱います。 （ステップ4.5 - 4.8）溶液の体積は、セクションのサイズによって異なります。顆と長骨のために100μlのための溶液50μlを使用してください。 3回（0.1％のTween 20を含んでいるPBS）PBSTで洗浄します。
5. 準備し、各セクションにブロッキング溶液を塗布し、室温で1時間加湿チャンバーでそれらをインキュベートします。
6. プライマリを持つセクションをインキュベート一晩4℃で抗体溶液（ウサギ抗マウスRunx2の、またはウサギ抗マウスDMP1）。 PBSで3回洗浄します。
7. 室温で2時間、二次抗体溶液（ヤギ抗ウサギアレクサフルオロ488）を用いて切片をインキュベートします。 PBSで3回洗浄します。
8. セクションの周りに水を拭き取り、スライド上のセクションをカバーするために円形にDAPIをドロップします。慎重にカバースリップを置きます。

5.共焦点顕微鏡

1. 488ミクロン（緑）から561ミクロン（赤）の範囲の波長で共焦点顕微鏡を用いた蛍光細胞画像をキャプチャします。 10X、20X、および63Xレンズを使用して^、19 200 Hzで、複数の積み重ねられた画像を撮影（1024×1024の寸法）。

結果

軟骨細胞は直接下顎頭と長骨における骨細胞（骨芽細胞および骨細胞）に変換します。

アグリカン 、軟骨形成のための重要な遺伝子は、主に早期に成熟した軟骨細胞¹⁸で表されます。その結果、 のAgg-Creを^ERT2年齢の2週間でのタモキシフェンの注射; ROSA26 ^{tdTomatoマウス}...

ディスカッション

技術的制限のために、 インビボでの細胞の挙動を研究することは常に困難です。しかし、細胞系譜トレース技術は、細胞生物学^7-9を研究するための強力なツールであることが証明されています。本研究では、さらに、免疫蛍光法と組み合わせることにより、このプロトコールを改良します。この方法では、細胞の運命は、系統追跡の適用を拡大する、複数の関連マーカーによ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS