שיתוף לוקליזציה של סמני שושלת תא ואת האיתותים העגבניות

Summary

פיתחנו שני סטים של התחקות ושילובים ^tdTomato Rosa26 (הביע בכל מקום בגוף בכל התאים) / Cre (לידי ביטוי במיוחד chondrocytes) עכברים: אחד עם 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ואחד עם immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים ממחישים את השינוי הישיר של כונדרוציטים לתוך תאי עצם.

Abstract

מערכת התחקות שושלת התא נעשתה שימוש בעיקר במחקרים בביולוגיה התפתחותית. שימוש recombinase Cre מאפשר ההפעלה של כתב קו תאים ספציפי וכל הצאצאים. הנה, השתמשנו שושלת תא התחקות טכניקה על מנת להוכיח כי chondrocytes ישירות להפוך אוסטאובלסטים ו osteocytes במהלך עצם ארוך ופיתוח condyle mandibular באמצעות שני סוגי Cre, Col10a1-Cre ו Aggrecan-Cre ^ERT2 (AGG-Cre ^ERT2), חצה עם Rosa26 ^tdTomato. שניהם Col10 ו aggrecan הם מוכרים היטב סמנים עבור chondrocytes.

על בסיס זה, פתחנו שיטת שושלת תאים חדשה התחקות בשיתוף עם גורל תא אימונוהיסטוכימיה אל פלורסנט להגדיר על ידי ניתוח הביטוי של סמני תאים ספציפיים. Runx2 (סמן תאים osteogenic בשלב מוקדם) ו הדנטין מטריקס protein1 (DMP1; כסמן תאים osteogenic בשלב מאוחר) היומשמש לזיהוי תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים ומצב הבידול שלהם. שילוב זה לא רק מרחיב את תחולת עקיבת שושלת תא, אלא גם מפשט את הדור של עכברים מתחמים. יתרה מכך, מספר, מיקום, וסטטוסי הבידול של צאצאים בתא ההורה מוצגים בו זמנית, מתן מידע רב יותר מאשר שושלת תא התחקות לבד. לסיכום, שיתוף היישום של טכניקות התחקות שושלת תא immunofluorescence הוא כלי רב עצמה על חקירת ביולוגיה של תא in vivo.

Introduction

במהלך הפיתוח, היווצרות העצם endochondral חשבונות עבור יותר מ -80% מנפח השלד. הוא האמין נרחב כי הוא מתחיל עם אפופטוזיס של כונדרוציטים היפרטרופית. בהמשך לכך, התאים ממח העצם הבסיסי לפלוש וליזום אנגיוגנזה, ואחריו בתצהיר עצם חדש על ידי העצם מארו ותאי הנגזרות periosteum ^1,2. גורל התא של כונדרוציטים היפרטרופית (HCS), לעומת זאת, כבר בעיה של הוויכוח במשך עשרות שנים ^3. בתחילה, HCS נחשב סוף מסלול הבידול הכונדרוציטים, אפופטוזיס נחשב בדרך כלל להיות מה עלה בגורלה של HCS. עכשיו, כמה חוקרים מציעים כי לפחות חלק HCS יכול לשרוד ולתרום היווצרות העצם endochondral. למרות שהציעו שהצמיחה chondrocytes צלחת הייתה היכולת transdifferentiate לתוך אוסטאובלסטים מבוסס על ultrastructure, מכתים immunohistochemical, ו במבחנה מחקרים ^46, אף אחת מהשיטות הללו were מכריע הוכחת תרומה הכונדרוציטים אל שושלת אוסטאובלסטים.

שושלת תא טכניקת ההתחקות מספקת דרך קפדנית יותר ללמוד גורל תא. בקצרה מדבר, אנזים recombinase, אשר באה לידי ביטוי רק סוג מסוים של התא, מגרה את הביטוי של הגן הכתב. בדרך זו, זה סוג של תא וצאצאיהם מסומנים ⁷ לצמיתות. מערכת Cre-loxP היא נפוצה עקיבת שושלת. Cre (אנזים recombinase) יהיה בלו רצף STOP בין שני אתרי loxP ולהפעיל את הכתב בבית (איור 1 א) שורת תאים ספציפית. במקרים מסוימים, החוקר יכול לבחור נקודת זמן מתאימה כדי להפעיל Cre באמצעות תרופה, כגון טמוקסיפן, גרימת Cre איחוי צורה שונה של קולטן אסטרוגן (Cre ^{ERT2) 8.} כתבים פלורסנט הפכו לסטנדרט השושלת התחקות ניסויים כי הם להפחית באופן דרמטי את המורכבותולשפר את הדיוק והיעילות של גורל התא התחקות ^8,9. tdTomato הופך את הבחירה הטובה ביותר בין כתבי ניאון שכן יש את חלבון פלואורסצנטי מבריקי epifluorescence החזק, מה שהופך אותו בקלות דמיין ⁷ (איור 1 א).

באמצעות השושלת Rosa26 ^tdTomato התחקות המערכת, הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים הראו כי HCS יכול לשנות הפנוטיפ שלהם לתוך תאי עצם במהלך ההתפתחות ^10-14. כדי להשיג זאת, פיתחנו שתי מערכות של התחקות שילובים עם Rosa26 ^tdTomato (ביטוי בכל מקום בכל התאים) / Cre (ספציפית chondrocytes) עכברים: 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ו immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים מראים כי שתי השיטות דרכים קיימא ללמוד גורל התא in vivo.

Protocol

כל הפרוטוקולים היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת טקסס A & M אוניברסיטת קולג 'של רפואת שיניים.

גידול בעלי חיים 1.

1. השתמש שלושה מודלים של בעלי חיים במחקר זה. כדי לחקור את גורלם של chondrocytes עובריים במבנה condyle, השימוש הראשון Col10a1-Cre ¹⁵ עכברים ולחצות אותם עם Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{tm9 (CAG-tdTomato) Hze} / J) עכברים להשיג Col10a1- עכברים Cre ו Rosa26 ^tdTomato. לאחר מכן, לחצות עכברים אלה עם עכברים 2.3Col1a1-GFP ^16. השתמש Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP עכברים לבצע את שושלת תא ניסויי התחקות (איור 1B).
2. כדי לחקור את גורלם של chondrocytes לאחר הלידה, לפי אותו נוהל כמו בשלב 1.1, אבל להשתמש ^ERT2 Aggrecan-cre (AGG-Cre ^ERT2קו ^17,18) ולשמור את ^ERT2 AGG-Cre; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP עכברים לבצע את שושלת תא ניסויי התחקות (תרשים 1C). להזריק טמוקסיפן על יום הלידה 14.
3. כדי לשלב את השושלת תא התחקות טכניקה עם immunofluorescence, לחצות AGG-Cre העכברים ^ERT2 ועכברים Rosa26 ^tdTomato. משתמשים בעכברים שנושאים שני הגנים בניסוי ולהזריק את טמוקסיפן על יום הלידה 3 (איור 1D).

2. הכנת חומר

1. ממיסים את אבקת טמוקסיפן באתנול 10% ו -90% שמן תירס בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל. המינון להזרקה הוא 75 מ"ג / ק"ג.
2. ממיסים את אבקת paraformaldehyde (PFA) ב PBS לריכוז של 4%, באמצעות 2 M מימה נתרן כדי להתאים את ערך ה- pH ל -7.4. השתמש 4% פתרון PFA כדי לתקן את הרקמה (להלן condyle mandibular ורגל האחוריות משמשות כאן) לאחר הקרבה. בגלל שלהרעילות, להתמודד עם PFA בשכונה עם כפפות facemask.
3. ממיסים את אבקת EDTA במים מזוקקים לריכוז של 10%, באמצעות 2 M מימה נתרן כדי להתאים את ערך ה- pH ל -7.4. השתמש 10% EDTA כדי decalcify condyle mandibular ורגל אחורית.
4. ממיסים אבקת סוכרוז PBS בריכוזים של 15% ו -30%. השתמש תמיסת סוכרוז כדי ליבש הרקמה לאחר decalcification.
5. ממיסים את אבקת hyaluronidase ב PBS בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל, pH 5.0. פתרון זה לאחזור אנטיגן immunofluorescence.
6. השתמש צינור 1.5 מ"ל להכין פתרון חסימת המכיל אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ו -20% סרום עיזים ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1.
7. השתמש צינור 1.5 מ"ל להכין פתרון נוגדן ראשוני המכיל סרום עיזים 2% ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. הריכוז של הנוגדן הראשוני הוא 1: 400 עבור Runx2 ו 1: 100 עבור DMP1.
8. השתמש צינור 1.5 מ"ל להכיןפתרון IgG הארנב כמו השליטה מכתימה immunofluorescent כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. הפתרון מכיל 2% נסיוב עז ב PBS. הריכוז של IgG הארנב לבקרת Runx2 הוא 1: 400; עבור DMP1, 1: 100. בצע את המכתים לניסוי ובקרה בעת ובעונה אחת.
9. השתמש צינור 1.5 מ"ל להכין פתרון נוגדנים משני המכיל סרום עיזים 2% ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. השתמש נוגדנים משני בדילול של 1: 500.

.3 סט הכנה המיקרוסקופית Confocal (Cell Lineage איתור בלבד, ללא שילוב עם Immunofluorescence)

1. להזריק טמוקסיפן בעכברי AGG-cre ^ERT2 בנקודת זמן מתאימה.
   1. ראשית, להסיר עכבר מהכלוב שלה. לאחר מכן, השתמשו באגודל ובאצבע המורה השמאלית כדי לתפוס את העור בצד האחורי של העכבר והפוך אותו, לחשוף את הבטן. השתמש ביד ימין להחזיק את המזרק. נקודת הכניסה האופטימלית עבור זריקה היא על lEFT או בצד ימין של hypogastrium, הימנעות הכבד וכיס.
   2. שמור את המזרק במקביל הרגליים האחוריות של העכבר להזריק intraperitoneally. המינון להזרקה הוא 75 מ"ג / ק"ג. המשקלים של עכברים בכל הגילאים 2 שבועות, 3 שבועות, ו -4 שבועות כ 7 - 9 גרם, 11 - 13 גרם, ו 16 - 18 גרם, בהתאמה.
2. להרדים את העכברים עם שילוב Xylazine / Ketaset.
   1. כדי להכין הפתרון עובד, הראשון לדלל את Xylazine ו Ketaset עם מים מזוקקים כדי בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​ו -5 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. לאחר מכן, לערבב את Xylazine ו Ketaset ב יחס של 1: 2. המינון להזרקה הוא 30 μl / g.
   2. להזריק כמו בשלב 3.1. אשר את ההרדמה על ידי צובט את קרסול העכבר. העכבר הוא לא מודע אם הוא לא מגיב.
3. Perfuse העכברים עם 4% PFA לאחר הרדמה.
   1. לאחר העכבר מאבד את הכרתו, לתקן את ארבע רגליו של העכבר על גבי הלוח כדי entirely לחשוף את הבטן.
   2. להרוות את הבטן עם אתנול 70% ולעשות כריתה מהבטן התחתונה לצוואר לאורך הקו האמצעי. לצבוט ובמקביל למשוך את העור לצדדים לרוחב כדי לחשוף את קרום הצפק. השתמש במספריים לנתיחה כדי לבצע כריתה אורכת.
   3. חותך ולהסיר את הצלעות הקדמיות כדי לחשוף את הלב. לנקב את הלב מן החדר השמאלי עם מזרק 22 G, להחזיק את המזרק, ובמקביל לחתוך את משבצת את אפרכסת ימין.
   4. לאט לאט להזריק את PFA 4%, אשר perfused לאורך מערכת הלב וכלי הדם בעוד גלי הדם מתוך חתך את אפרכסת ימין. היקף PFA עבור זלוף הוא 1 מ"ל / גרם. בצע פעולה זו בתוך ארון בטיחות ביולוגית אני בכיתה שקשה-ducted למערכת הפליטה הבניין.
4. קלף את העור העכבר ולשים את כל הגוף לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של 4% PFA לתקן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
5. השתמש במספריים לנתיחה # 3 ו # 5 מלקחיים כדי להסיר את הלסת התחתונה בזהירות רגל אחורית מהגוף וכדי להסיר את השרירים והגידים על פני השטח. בצע פעולה זו בתוך ארון בטיחות ביולוגית אני בכיתה שקשה-ducted למערכת הפליטה הבניין.
6. חותך את הלסת התחתונה לתוך שתי חתיכות באזור הדיסטלי של הטוחנת השלישית. באופן דומה, לחתוך את עצם הירך לבין השוקה ב midshaft לחשוף את חלל מח עצם על מנת להאיץ decalcification. מכניסים את החלק הכולל את תהליך condyle ו condylar ויחד עם הרגל האחורית לתוך 40 מ"ל של EDTA 10% עד decalcify ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 4 ימים בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל.
7. השתמש 50 מיליליטר של סוכרוז 15% כדי לייבש את condyle ורגל אחורית הלילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר.
8. השתמש 30% סוכרוז מייבש את condyle ורגל אחורית הלילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר.
9. במישור sagittal, להטביע את המדגם עםאוקטובר על צלחת חיתוך במכונה cryosection.
   1. אופקי להניח את condyle או הרגל האחורית העובש הגובר. להטביע את הרקמה ב אוקטובר ולהשאיר אותה במכונה cryosection עד ב- OCT קופא.
   2. הר לחסום אוקטובר על צלחת חיתוך. מתן כ 15 דקות לפני החיתוך, כדי להבטיח כי ב- OCT הוא קפוא לחלוטין.
10. חותך את condyle ורגל אחורית למקטעים של 10 מיקרומטר. אסוף בסעיפים בשקופיות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
11. דגירה שקופיות בתא 37 ° C כדי להסיר את המים לפני מכתים.
12. שטפו את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות.
13. תמחק את המים סביב כל קטע. השתמשו בעט מחסום הידרופובי להקיף את הסעיפים ושחרר DAPI או שאינם fluorescing פתרון גובר אנטי לדעוך לתוך המעגל. בזהירות להניח את התלוש לכסות.

4. מכתים immunohistochemical עבור Runx2 ו DMP1

הערה: con IgGtrol הכרחי מכתים immunohistochemical להימנע אותות חיוביים שגויים. המכתים עבור הקבוצות מלאות הניסיוניות לבצעו בעת ובעונה אחת.

1. דגירה השקופיות בתא 37 ° C כדי להסיר את המים לפני מכתים.
2. שטפו את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים.
3. השתמש עט מחסום הידרופובי להקיף את כל החלקים בשקופית. משלב זה, להוסיף את כל הפתרון המוכן למעגל לכיסוי החלק לחלוטין.
4. פנקו את החלקים עם hyaluronidase בתא לח על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. היקף הפתרון (בצעדים 4.5 - 4.8) תלוי בגודל של הסעיף. השתמש 50 μl של פתרון עבור condyle ו 100 μl של העצם הארוך. לשטוף עם PBST (PBS המכיל 0.1% Tween 20) שלוש פעמים.
5. כן וליישם את הפתרון החוסם כל מקטע דגירה אותם בתא לח במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
6. דגירה החלקה עם עיקריהפתרון נוגדן (Runx2 אנטי עכבר ארנב, או ארנבת אנטי עכבר DMP1) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף עם שלוש פעמים PBS.
7. דגירה החלקה עם פתרון נוגדנים משני (ארנב נגד עז, ​​Alexa פלואוריד 488) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף עם שלוש פעמים PBS.
8. נגב את המים סביב סעיף ושחרר DAPI למעגל כדי לכסות את החלק בשקופית. בזהירות להניח את התלוש לכסות.

5. מיקרוסקופי Confocal

1. צלמו תמונות תא ניאון באמצעות מיקרוסקופ confocal באורכי גל הנעים בין 488 מיקרומטר (ירוק) 561 מיקרומטר (אדום). קח תמונות מוערמים מרובים ב 200 הרץ (מידות של 1,024 × 1,024) ¹⁹ באמצעות 10X, 20X, ו 63X עדשות.

תוצאות

Chondrocytes ישירות להפוך תאי עצם (אוסטאובלסטים ו Osteocytes) ב mandibular condyle ולונג עצם.

Aggrecan, גן קריטי chondrogenesis, בא לידי ביטוי בעיקר chondrocytes מוקדם ובוגרת ^18. כתוצאה מכך, הזרקה של טמוקסיפן 2 שב?...

Discussion

בשל מגבלות טכנולוגיות, זה תמיד קשה כדי לחקור את התנהגותם של תאים in vivo. עם זאת, הטכניקה התחקות תא השושלת היא להוכיח להיות כלי רב עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא ^7-9. במחקר זה, אנו עוד יותר לשפר בפרוטוקול זה על ידי שילוב עם immunofluorescence. בדרך זו, גורל תא יכול להיות מוגד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS