셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

요약

면역과 (조골 세포에 특정) 2.3Col1a1-GFP 하나 하나 (뼈 세포에 특정) : 우리는 두 / Cre 호텔이 마우스를 (특히 연골 세포에서 발현) (보편적으로 모든 세포에서 발현) Rosa26의 ^tdtomato의 조합을 추적 세트를 개발했다. 데이터는 골 연골 세포로의 직접적인 변환을 보여준다.

초록

셀 혈통 추적 시스템이 발달 생물학 연구에서 주로 사용되어왔다. Cre 호텔 재조합 효소의 사용은 특정 세포주 모든 자손의 리포터의 활성을 허용한다. 여기, 우리가 연골 세포를 직접 긴 뼈와 Cre 호텔, Col10a1-Cre 호텔과 Aggrecan-Cre 호텔 ^ERT2 (AGG-Cre 호텔 ^ERT2) 두 종류를 사용하여 하악 외과 개발 과정에서 조골 세포와 골 세포로 변형을 입증하는 기술을 추적 세포 혈통을 사용 Rosa26 교차 ^tdTomato. Col10과 aggrecan 모두 연골 세포에 대한 마커를 잘 인식하고 있습니다.

이를 바탕으로, 우리는 특정 세포 마커의 발현을 면역 형광 분석하여 정의 간 세포 운명과 함께 추적하는 새로운 방법 세포 계보를 개발했다. Runx2 (초기 단계의 조골 세포에 대한 마커) 및 상아질 매트릭스 protein1 (DMP1; 말기 조골 세포 마커) 있었다연골 유래 뼈 세포 및 분화 상태를 식별하는 데 사용된다. 이 조합은 셀의 혈통 추적의 적용을 넓혀, 또한 화합물 마우스의 생성을 간소화 아닙니다. 더 중요한 것은, 부모 세포 자손의 수, 위치 및 분화 상태는 단독으로 추적 세포 혈통보다 더 많은 정보를 제공하는 동시에 표시됩니다. 결론적으로, 셀 혈통 추적 기술과 면역의 공동 응용 프로그램은 생체 내에서 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구입니다.

서문

개발하는 동안, 연골 내 골 형성의 골격 체적의 80 % 이상을 차지한다. 널리은 비대 연골 세포의 사멸로 시작하는 것으로 생각된다. 그 후, 기본 골수의 세포 침입과 뼈 marrow- 및 골막 유래 세포 ^1,2에 의해 새로운 뼈 증착 다음에 혈관 신생을 시작합니다. 비대 연골 세포 운명 HCS ()는, 그러나, 수십 년 ³ 논쟁의 문제였다. 초기의 HC는 연골 세포 분화 경로의 종료로 간주하고, 일반적으로 아폽토시스의 HC의 궁극적 운명 것으로 생각되었다. 지금, 일부 연구자들은 적어도 일부의 HC가 살아남을 수 및 연골 뼈 형성에 기여하는 것이 좋습니다. 그들이 그 성장을 제안했지만 판 연골 세포는 미세 구조, 면역 조직 화학 염색을 기반으로 조골 세포에 transdifferentiate 수있는 능력을 가지고 있었고, 시험 관내에서, ^46이 방법 w 전혀 연구되지조골 세포 계보에 연골 세포의 기여를 입증에 결정적인 감수해야.

셀 혈통 추적 기술은 세포의 운명을 연구하는보다 엄격한 방법을 제공합니다. 간단히 말하자면, 오직 셀의 특정 유형에서 발현되는 재조합 효소, 리포터 유전자의 발현을 자극한다. 이러한 방식으로,이 세포의 종류와 그 후손 영구적 ^7로 표시된다. Cre 호텔-에 loxP 시스템은 일반적으로 혈통 추적에 사용됩니다. CRE (재조합 효소 효소) 둘에 loxP 부위 사이 STOP 서열을 절제하고 특정 세포주 (도 1a)에서 리포터를 활성화한다. 일부의 경우, 연구자는 에스트로겐 수용체 (Cre 호텔 ^{ERT2) (8)의} 수정 된 형태로 융합 Cre 호텔을 일으키는 등 타목시펜과 같은 약물을 사용하여 Cre 호텔을 활성화 유리한 시점을 선택할 수 있습니다. 형광 기자는 극적으로 복잡성을 줄일 수 있기 때문에 실험을 추적 혈통의 표준이되었다및 ^{8,9 추적} 세포 운명의 정확성과 효율성을 향상시킨다. 그것은 쉽게 ⁷ (도 1A)를 시각화하게 밝은 형광 단백질과 강한 표면 형광을 갖기 때문에 tdTomato 형광 리포터 중에서 최상의 선택되고있다.

시스템을 추적 Rosa26 ^{tdTomato 계보를} 사용하여, 우리 그룹과 다른 연구자의 HC 개발 ^10-14 동안 뼈 세포로 자신의 표현형을 변경할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 2.3Col1a1-GFP (조골 세포에 특정)과 면역 (뼈 세포에 특정) :이 작업을 수행하기 위해, 우리는 Rosa26의 ^tdtomato (유비쿼터스 식 모든 셀에서) / Cre 호텔 (연골 세포에 특정) 마우스와 조합을 추적하는 두 세트를 개발했다. 데이터는 두 가지 방법이 생체 내에서 세포의 운명을 연구하는 가능한 방법이라는 것을 보여줍니다.

프로토콜

모든 프로토콜을 검토하고 텍사스 A & 치과 M 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 동물 사육

1. 이 연구에서 세 동물 모델을 사용합니다. 먼저 사용 Col10a1-Cre 호텔 ¹⁵ 쥐 외과 형성의 배아 연골 세포의 운명을 조사하고 Rosa26 ^tdTomato로 교차합니다 (B6, 129S6- GT는 (ROSA) 26Sor ^{TM9 (CAG-tdTomato) Hze} / J) 마우스를 Col10a1-를 얻기 위해 CRE와 Rosa26 ^tdTomato 쥐. 다음으로, 2.3Col1a1-GFP 마우스 ^16이 쥐를 교차. Col10a1-Cre 호텔을 사용합니다; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP 마우스는 셀 혈통 추적 실험 (그림 1B)를 수행 할 수 있습니다.
2. 출생 후 연골 세포의 운명을 연구하기 위해, 단계 1.1에서와 동일한 절차를 수행하지만, Aggrecan-CRE의 ^ERT2 (AGG-Cre 호텔 ^ERT2를 사용) ^{17, 18} 라인과 AGG-Cre 호텔 ^ERT2을 유지; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP 마우스는 세포 계보 추적 실험 (도 1C)을 수행한다. 생후 14 일에 타목시펜을 주입한다.
3. 면역과 기술을 추적 세포 혈통을 결합하려면, AGG-Cre 호텔 ^{ERT2 마우스와} Rosa26 ^{tdTomato 마우스를} 교차. 실험에 모두 유전자를 가지고 마우스를 사용하여 출생 후 3 일 (그림 1D)에 타목시펜을 주입.

2. 재료 준비

1. 10 ㎎ / ㎖의 농도에서 10 % 에탄올 및 90 % 옥수수 유에서 타목시펜 분말을 녹인다. 주사 투여 량은 75 ㎎ / ㎏이다.
2. 7.4의 pH 값을 조정하기 위해 2 M 나트륨 수화물을 사용하여 4 %의 농도로 PBS에 파라 포름 알데히드 (PFA) 분말을 녹인다. 희생 후 조직 (하악 외과와 뒷다리가 여기에 사용되는)를 해결하기 위해 4 % PFA 솔루션을 사용합니다. 때문에 자사의독성, 장갑과 안면 마스크와 후드에 PFA를 처리합니다.
3. 7.4의 pH 값을 조정하기 위해 2 M 나트륨 수화물을 사용하여 10 %의 농도로 증류수에 EDTA 분말을 녹인다. 하악 외과와 뒷다리를 석회 10 %의 EDTA를 사용합니다.
4. 15 %와 30 %의 농도로 PBS에서 자당 분말을 녹여. 탈회 후 조직을 탈수 자당 솔루션을 사용합니다.
5. 2 ㎎ / ㎖, pH 5.0으로의 농도로 PBS에 히알루 분말을 녹인다. 이 솔루션은 면역 항원 검색을위한 것입니다.
6. Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 20 %의 염소 혈청이 포함 된 차단 용액을 제조 1.5mL 용량 튜브를 사용한다.
7. Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 2 % 염소 혈청을 포함하는 일차 항체 용액을 제조 1.5mL 용량 튜브를 사용한다. Runx2 400 및 1 : 100 DMP1 대한 일차 항체의 농도는 1이다.
8. 제조 1.5 ㎖의 튜브를 사용하여거짓 긍정적 인 결과를 피하기 위해 면역 염색에 대한 제어와 토끼 IgG의 솔루션입니다. 이 솔루션은 PBS의 2 % 염소 혈청이 포함되어 있습니다. Runx2 제어 토끼 IgG의 농도는 1 : 400; 100 : DMP1, 1. 동시에 실험 및 제어 염색을 수행합니다.
9. Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 2 % 염소 혈청을 포함하는 이차 항체 용액을 제조 1.5 ㎖의 튜브를 사용한다. 500 : 1의 희석에 차 항체를 사용합니다.

3. 슬라이드 공 초점 현미경을위한 준비 (만 추적 휴대 리니지, 면역 형광 아니오 조합)

1. 유리한 시점에서 AGG-CRE ^ERT2 마우스에서 타목시펜을 주입한다.
   1. 첫째, 케이지에서 마우스를 제거합니다. 그런 다음, 복부를 노출, 마우스의 뒷면에있는 피부를 잡아 뒤집 왼쪽 엄지와 검지 손가락을 사용합니다. 주사기를 잡고 오른손을 사용합니다. 주입을위한 최적의 엔트리 포인트는 L에EFT 또는 hypogastrium의 오른쪽, 간 및 방광을 피하는.
   2. 마우스의 뒷다리에 주사기 평행을 유지하고 복강 주사. 주사 투여 량은 75 ㎎ / ㎏이다. 각각 18g - 9g, 11 - - 13g, 16 이주 3 주, 그리고 옛 사주의 나이에 마우스의 무게는 약 7이다.
2. 크 실라 / Ketaset 조합으로 쥐를 마취.
   1. 작동 용액을 제조하기 위해, 각각 제 1 ㎎ / ㎖, 5 ㎎ / ㎖의 농도로 증류수 및 크 실라 Ketaset 희석. 이 비율 다음으로, (1)의 크 실라와 Ketaset 섞는다. 주사 투여 량은 30 μL / g이다.
   2. 단계 3.1에서와 같이 주입한다. 마우스의 발목을 곤란하게하여 마취를 확인합니다. 그것은 아무 반응이없는 경우 마우스가 의식이다.
3. 마취 후 4 % PFA와 마우스를 관류.
   1. 마우스가 의식을 잃게 한 후, entirel하기 위해 보드에 마우스의 4 개의 다리를 고정y는 복부를 노출합니다.
   2. 70 % 에탄올로 복부를 포화 중간 선을 따라 목에 하복부에서 절제를합니다. 복막 멤브레인을 나타 내기 위해 측면에 피부를 당겨 동시에 핀치합니다. 길이 절단을 만들기 위해 해부 가위를 사용합니다.
   3. 잘라와 마음을 노출 전면 갈비뼈를 제거합니다. 오른쪽 귓바퀴에 슬롯을 잘라 동시에, 22 G 주사기와 좌심실에서 심장에 구멍 주사기를 개최합니다.
   4. 천천히 심혈을 따라 관류하는 4 % PFA를 주입하는 동안 오른쪽 귓바퀴에서 컷 아웃 혈액 플러시. 관류를위한 PFA의 부피 1 ㎖ / g이다. 하드 덕트 건물의 배기 시스템에있는 클래스 I의 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다.
4. 마우스의 피부를 벗겨 및 4 ℃에서 하룻밤 해결하기 위해 4 % PFA 40 ml에 포함 된 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 몸 전체를 넣어.
5. 조심스럽게 몸에서 하악과 뒷다리를 제거하는 해부 가위와 # 3, # 5 집게를 사용하여 표면에 근육과 힘줄을 제거 할 수 있습니다. 하드 덕트 건물의 배기 시스템에있는 클래스 I의 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다.
6. 세 번째 몰의 말단 부위에 두 개의 조각으로 하악을 잘라. 마찬가지로, 탈회를 가속화하기 위해 골수 공동을 노출 간부의 대퇴골과 경골을 자른다. 외과와 과두 과정을 포함하는 부분을 넣고 10 % EDTA의 40 ㎖의에 뒷다리와 함께 2 4 ° C에서 석회하기 - 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 사일.
7. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 4 ° C에서 외과 하룻밤 뒷다리를 탈수 15 % 자당의 50 ㎖를 사용합니다.
8. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에서 밤새 4 ° C에서 외과와 뒷다리를 탈수 30 % 자당을 사용합니다.
9. 시상면 함께 샘플을 포함동결 절단 (Cryosections) 기계의 절삭 접시에 10월
   1. 수평 외과 또는 설치 금형의 뒷다리를하다. OCT에서 조직을 잠수함과 OCT를 정지 할 때까지 동결 절단 (Cryosections) 기계에 둡니다.
   2. 절단 접시에 OCT의 블록을 탑재합니다. OCT를 완전히 얼어 붙은 있는지 확인하기 위해 절단하기 전에 약 15 분 동안 기다립니다.
10. 10 μm의 섹션으로 외과와 뒷다리를 잘라. -20 ° C에서 슬라이드 및 저장에 섹션을 수집합니다.
11. 염색하기 전에 물을 제거하기 위해 37 °의 C 챔버 슬라이드를 부화.
12. 5 분 동안 증류수로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
13. 각 섹션 주위에 물을 닦아냅니다. 섹션을 원과 원에 DAPI 또는 비 형광 안티 - 페이드 장착 솔루션을 드롭 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 조심스럽게 커버 슬립을 누워.

Runx2와 DMP1 4. 면역 조직 화학 염색

참고 : IgG의 콘면역 조직 화학 염색이 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 트롤이 필요합니다. 실험 및 대조군에 대한 염색은 동시에 수행 될 필요가있다.

1. 염색하기 전에 물을 제거하기 위해 37 °의 C 챔버 슬라이드를 부화.
2. 증류수로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
3. 슬라이드의 모든 부분에 동그라미를하는 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 이 단계에서 완전히 섹션을 다루 원에 준비된 솔루션을 모두 추가 할 수 있습니다.
4. 30 분 동안 37 ° C에서 습기 챔버에서 히알루와 섹션을 처리합니다. (단계 4.5 - 4.8) 용액의 부피는 부분의 크기에 의존한다. 긴 뼈의 외과 용 용액 50 ㎕를 100 μl를 사용합니다. (0.1 % 함유 PBS 트윈 20) PBST로 3 회 씻는다.
5. 준비하고 각 섹션에 블로킹 용액을 적용하고, 실온에서 1 시간 동안 습윤 챔버에이를 부화.
6. 차와 섹션을 품어밤새 4 ° C에서 항체 용액 (토끼 항 - 마우스의 Runx2, 또는 토끼 항 - 마우스 DMP1). PBS로 3 회 세척한다.
7. 실온에서 2 시간 동안 차 항체 용액 (염소 항 - 토끼 알렉사 형석 488)와 섹션을 인큐베이션. PBS로 3 회 세척한다.
8. 절 주위에 물을 닦아 슬라이드 섹션을 다루 원에 DAPI 놓습니다. 조심스럽게 커버 슬립을 누워.

5. 공 초점 현미경

1. 488 μm의 (녹색)에서 561 μm의 (적색)에 이르기까지 다양한 파장에서 공 초점 현미경을 사용하여 형광 세포 이미지를 캡처합니다. 10X, 20X 및 63X 렌즈를 사용하여 ¹⁹ 200 Hz에서 여러 누적 된 이미지를 가지고 (1,024 × 1,024의 치수).

결과

연골 세포는 직접 하악 외과와 긴 뼈의 뼈 세포 (조골 세포와 골 세포)로 변환.

Aggrecan, 연골위한 중요한 유전자는 주로 조기 성숙 연골 세포 ^(18)로 표현된다. 그 결과, AGG-Cre 호텔 ^ERT2 연령 2 주에서 타목시펜의 주입; Rosa26 ^{tdTomato 마우스는} 모든 연골 세포와 자신의 딸 세?...

토론

기술적 한계로 인해, 생체 내에서 세포의 거동을 조사하는 것이 어렵다. 그러나, 셀 혈통 추적 기술은 세포 생물학 ^7-9을 연구하기위한 강력한 도구로 증명된다. 본 연구에서는 상기 면역과 조합하여 프로토콜을 향상시킨다. 이러한 방식으로, 세포 운명 리니지 추적의 적용을 넓혀 연관된 여러 마커에 의해 정의 될 수있다. 또한, 면역, 토마토 신호의이 공동 현지화 동시에 단독으로 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS