Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

Resumo

Nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações em Rosa26 ^tdtomato (ubiquamente expressa em todas as células) / Cre (especificamente expresso em condrócitos) camundongos: um com 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e um com imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram a transformação directa de condrócitos em células ósseas.

Resumo

O sistema de rastreamento de linhagem celular foi usado predominantemente em estudos de biologia do desenvolvimento. A utilização da recombinase Cre permite a activação do repórter em uma linha celular específica e toda a progénie. Aqui, utilizou-se a linhagem de células rastreio técnica para demonstrar que os condrócitos transformar directamente em osteoblastos e os osteócitos durante ossos longos e desenvolvimento côndilo mandibular utilizando dois tipos de Cre, Col10a1-Cre e agrecan-Cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2), cruzados com Rosa26 ^tdTomato. Ambos Col10 e agrecano marcadores são bem reconhecido para condrócitos.

Nesta base, nós desenvolvemos uma nova linhagem de células método de rastreio em conjunto com o destino celular imuno-fluorescente para definir por meio da análise da expressão de marcadores de células específicos. Runx2 (um marcador de células osteogênicas em início de carreira) e protein1 matriz de dentina (DMP1; um marcador para células em estágio final osteogênicos) foramutilizado para identificar as células de osso derivadas de condrócitos e o seu estado de diferenciação. Esta combinação não só amplia a aplicação de rastreio linhagem celular, mas também simplifica a geração de ratinhos compostos. Mais importante, os status de número, a localização e diferenciação de progênie de células-mãe são exibidos simultaneamente, fornecendo mais informações do que a linhagem celular de rastreamento sozinho. Em conclusão, a co-aplicação de técnicas de rastreio de linhagem celular e de imunofluorescência é uma ferramenta poderosa para investigar a biologia de células in vivo.

Introdução

Durante o desenvolvimento, a formação de osso endocondral responde por mais de 80% do volume do esqueleto. Acredita-se que começa com a apoptose de condrócitos hipertróf icos. Subsequentemente, as células da medula óssea subjacente invadir e iniciar angiogénese, seguido por nova deposição óssea por marrow- óssea e células derivadas de periósteo ^1,2. O destino de células de condrócitos hipertróficas (HCs), no entanto, tem sido um tema de debate durante décadas ^3. Inicialmente, foram consideradas HCs ser o final da via de diferenciação de condrócitos, e a apoptose foi geralmente considerado para ser o destino final de HCs. Agora, alguns investigadores sugerem que pelo menos alguns HCs poderia sobreviver e contribuir para a formação de osso endocondral. Embora eles proposto que o crescimento dos condrócitos placa tinha a capacidade de transdiferenciar em osteoblastos com base em ultra-estrutura, coloração imuno-histoquímica, e estudos in vitro, ^46, nenhum destes métodos were definitiva em condrócitos demonstrando contribuição para a linhagem dos osteoblastos.

A técnica de linhagem celular de rastreamento fornece uma maneira mais rigorosa para estudar o destino celular. Resumidamente falando, uma enzima recombinase, o qual é expresso apenas em um tipo específico de célula, estimula a expressão do gene repórter. Desta forma, este tipo de célula e seus descendentes são permanentemente marcado ^7. O sistema Cre-loxP é comumente usado no rastreamento de linhagem. Cre (a enzima recombinase) vai excisar a sequência de paragem entre os dois locais loxP e activar o repórter em uma linha celular específica (Figura 1A). Em alguns casos, o investigador pode escolher um ponto de tempo favorável para activar Cre usando uma droga, tal como tamoxifeno, causando Cre para fundir a uma forma modificada do receptor de estrogénio (Cre ^{ERT2) 8.} repórteres fluorescentes tornaram-se o padrão na linhagem rastreamento experimentos porque reduzem drasticamente a complexidadee melhorar a precisão e eficiência da célula destino traçado ^8,9. tdTomato está se tornando a melhor escolha entre os repórteres fluorescentes uma vez que tem o mais brilhante proteína fluorescente ea epifluorescência mais forte, tornando-se facilmente visualizado ⁷ (Figura 1A).

Ao utilizar o Rosa26 ^tdTomato linhagem sistema de detecção, o nosso grupo e outros investigadores mostraram que HCs pode alterar o seu fenótipo em células ósseas durante o desenvolvimento ^10-14. Para conseguir isso, nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações com Rosa26 ^tdtomato (expressão omnipresente em todas as células) / Cre (específico para condrócitos) ratos: 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram que ambos os métodos são meios viáveis para estudar o destino celular in vivo.

Protocolo

Todos os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Texas A & M University College of Dentistry.

Reprodução 1. animal

1. Use três modelos animais neste estudo. Para investigar o destino dos condrócitos embrionárias na formação côndilo, primeiro uso Col10a1-Cre ¹⁵ ratos e passe com Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{tm9 (CAG-tdTomato) Hze} / J) ratos para obter Col10a1- Cre e Rosa26 ^tdTomato ratinhos. Em seguida, atravessar esses camundongos com 2.3Col1a1-GFP ratos ^16. Use Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP para executar as experiências de rastreio linhagem celular (Figura 1B).
2. Para estudar o destino dos condrócitos pós-natal, siga o mesmo procedimento como no passo 1.1, mas usar o ^ERT2 agrecan-cre (Agg-Cre ^ERT2) ^17,18 linha e manter a Agg-Cre ^ERT2; Rosa26 ^tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP para executar as experiências de rastreio linhagem celular (Figura 1C). Injectar tamoxifeno no dia pós-natal 14.
3. Para combinar a linhagem celular de rastreamento técnica com imunofluorescência, atravessar ratos Agg-Cre ^ERT2 e camundongos Rosa26 ^tdTomato. Use ratinhos que transportam ambos os genes na experiência e injectar as tamoxifeno no dia pós-natal 3 (Figura 1D).

2. Preparação de Material

1. Dissolve-se o pó de tamoxifeno em 10% de etanol e óleo de milho a 90% a uma concentração de 10 mg / ml. A dosagem para injecção é de 75 mg / kg.
2. Dissolve-se o pó de paraformaldeído (PFA) em PBS a uma concentração de 4%, com 2 M de hidrato de sódio para ajustar o valor do pH para 7,4. Use 4% de solução PFA para fixar o tecido (o côndilo mandibular e perna são usados ​​aqui) após o sacrifício. Devido à suatoxicidade, lidar com PFA na capa com luvas e uma máscara.
3. Dissolve-se o pó de EDTA em água destilada a uma concentração de 10%, com 2 M de hidrato de sódio para ajustar o valor do pH para 7,4. Use 10% EDTA a descalcificação do côndilo mandibular e perna.
4. Dissolve-se o pó de sacarose em PBS a concentrações de 15% e 30%. Use a solução de sacarose para desidratar o tecido após descalcificação.
5. Dissolve-se o pó de hialuronidase em PBS a uma concentração de 2 mg / ml, pH 5,0. Esta solução é para a recuperação de antigénio de imunofluorescência.
6. Utilizar um tubo de 1,5 ml para preparar uma solução de bloqueio que contém 3% de albumina de soro bovino (BSA) e soro de cabra a 20% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente.
7. Utilizar um tubo de 1,5 mL, para preparar uma solução de anticorpo primário que contém soro de cabra a 2% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. A concentração do anticorpo primário é de 1: 400 para Runx2 e 1: 100 para DMP1.
8. Utilizar um tubo de 1,5 mL, para preparara solução de IgG de coelho como controlo para a coloração de imunofluorescência para evitar resultados positivos falsos. A solução contém soro de cabra a 2% em PBS. A concentração do IgG de coelho de controlo Runx2 é de 1: 400; para DMP1, 1: 100. Realizar o experimento e controle coloração simultaneamente.
9. Utilizar um tubo de 1,5 ml para preparar uma solução de anticorpo secundário que contém soro de cabra a 2% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. Utilizar o anticorpo secundário com uma diluição de 1: 500.

3. Deslize Preparação para microscopia confocal (Lineage celular Rastreamento Apenas, nenhuma combinação com Imunofluorescência)

1. Injectar tamoxifeno na-cre Agg ^ERT2 ratos em um ponto de tempo favorável.
   1. Em primeiro lugar, remover um mouse de sua gaiola. Em seguida, use o polegar eo dedo indicador esquerdo para agarrar a pele na parte de trás do rato e entregá-lo, expondo o abdômen. Use a mão direita para segurar a seringa. O ponto de entrada óptima para a injecção é a Left ou lado direito do hipogástrio, evitando o fígado e bexiga.
   2. Manter a seringa paralelo com as pernas traseiras do mouse e injectar por via intraperitoneal. A dosagem para injecção é de 75 mg / kg. Os pesos dos ratos nas idades de 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas de idade são de aproximadamente 7-9 g, 11-13 g, e 16-18 g, respectivamente.
2. Anestesiar os ratos com uma combinação Xilazina / Ketaset.
   1. Para preparar a solução de trabalho, em primeiro lugar diluir a xilazina e Ketaset com água destilada a uma concentração de 1 mg / ml e 5 mg / ml, respectivamente. Em seguida, misturar a xilazina e Ketaset em uma proporção de 1: 2. A dosagem para injecção é de 30 ul / g.
   2. Injectar como no passo 3.1. Confirmar a anestesia por beliscar o tornozelo do mouse. O mouse é inconsciente, se não tem reação.
3. Perfundir os ratos com PFA 4% após anestesia.
   1. Após o mouse perde a consciência, corrigir as quatro pernas do mouse em uma placa de entirely expor o abdômen.
   2. Saturar o abdômen com etanol 70% e fazer uma excisão da parte inferior do abdómen para o pescoço ao longo da linha média. Comprima e, simultaneamente, puxa a pele para os lados laterais para revelar a membrana peritoneal. Use tesouras de dissecação para fazer uma excisão longitudinal.
   3. Cortar e remover as costelas frente para expor o coração. Perfurar o coração do ventrículo esquerdo com uma seringa G 22, segure a seringa, e, simultaneamente, cortar uma abertura na aurícula direita.
   4. Lentamente injetar a PFA 4%, o que é perfundido ao longo do sistema cardiovascular enquanto as ondas de sangue para fora do corte da aurícula direita. O volume do PFA para perfusão é de 1 ml / grama. Execute esta etapa em uma cabine de segurança biológica Classe I que é difícil-canalizado para o sistema de escape edifício.
4. Retire a pele do rato e colocar todo o corpo para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml que contém 40 ml de 4% de PFA para fixar durante a noite a 4 ° C.
5. Use tesouras de dissecação e # 3 e # 5 fórceps para remover cuidadosamente a mandíbula e perna traseira do corpo e para remover os músculos e tendões na superfície. Execute esta etapa em uma cabine de segurança biológica Classe I que é difícil-canalizado para o sistema de escape edifício.
6. Cortar a mandíbula em duas peças na região distal do terceiro molar. Do mesmo modo, cortar o fémur e a tíbia, na parte média da diáfise os para expor a cavidade da medula óssea, a fim de acelerar a descalcificação. Colocar a parte que inclui o processo de côndilo e condilar e juntamente com a perna traseira em 40 ml de 10% de EDTA para descalcificar a 4 ° C durante 2 - 4 dias num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
7. Utilizar 50 ml de 15% de sacarose para desidratar o côndilo e pata traseira durante a noite a 4 ° C num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
8. Usar 30% de sacarose para desidratar o côndilo e pata traseira durante a noite a 4 ° C em um tubo de 50 ml de centrífuga de polipropileno.
9. Ao longo do plano sagital, incorporar a amostra comOutubro sobre a placa de corte na máquina de criocorte.
   1. Horizontalmente deitou a cabeça da mandíbula ou a pata traseira no molde de montagem. Mergulhe o tecido em outubro e deixá-lo na máquina criocorte até o outubro congela.
   2. Monte o bloco de outubro sobre a placa de corte. Esperar por cerca de 15 minutos antes de cortar para garantir que o OCT é completamente congelado.
10. Cortar a cabeça da mandíbula e perna em seções de 10 mícrons. Recolher as secções em lâminas e armazenar a -20 ° C.
11. Incubar as lâminas numa câmara de 37 ° C para remover a água antes da coloração.
12. Lavar as lâminas duas vezes com água destilada durante 5 minutos.
13. Limpe a água em torno de cada seção. Use uma caneta barreira hidrofóbica para circundar as seções e soltar DAPI ou solução de montagem anti-fade não-fluorescente dentro do círculo. Estabeleço com cuidado a tampa de deslizamento.

4. imuno coloração para Runx2 e DMP1

NOTA: O IgG controlo é necessário para coloração imuno-histoquímica para evitar sinais de falsos-positivos. A coloração para os grupos experimentais e de controlo necessita de ser realizados simultaneamente.

1. Incubar as lâminas numa câmara de 37 ° C para remover a água antes da coloração.
2. Lavar as lâminas duas vezes com água destilada.
3. Use a caneta barreira hidrofóbica para circundar todas as seções no slide. A partir deste passo, adicionar toda a solução preparada para dentro do círculo para cobrir completamente as secções.
4. Trate as seções com hialuronidase em câmara húmida a 37 ° C durante 30 minutos. O volume da solução (em passos de 4,5 - 4,8) depende do tamanho da secção. Use 50 ml de solução para o côndilo e 100 ul para o osso longo. Lavar com PBST (PBS que contém 0,1% de Tween 20), três vezes.
5. Preparar e aplicar a solução de bloqueio a cada secção e incubar numa câmara húmida durante 1 h à temperatura ambiente.
6. Incubar as seções com primárioA solução de anticorpo (Runx2 de coelho anti-rato, coelho ou anti-ratinho DMP1) a 4 ° C durante a noite. Lavar com PBS três vezes.
7. Incubam-se as secções com solução de anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho, Alexa Fluor 488) durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com PBS três vezes.
8. Limpe a água ao redor da seção e soltar DAPI para dentro do círculo para cobrir a seção sobre o slide. Estabeleço com cuidado a tampa de deslizamento.

5. Microscopia Confocal

1. Capturar imagens de células fluorescentes utilizando um microscópio confocal em comprimentos de onda que vão de 488 uM (verde) a 561 uM (vermelho). Tomar várias imagens empilhadas a 200 Hz (dimensões de 1.024 × 1.024) ¹⁹ utilizando 10X, 20X e 63X lentes.

Resultados

Condrócitos Diretamente transformar em células ósseas (osteoblastos e osteócitos) no Mandibular Condyle e Long Bone.

Agrecano, um gene crítico para chondrogenesis, se expressa principalmente no início e maduros condrócitos ^18. Como resultado, a injecção de tamoxifeno às 2 semanas de idade em Agg-Cre ^ERT2; Camundongos Rosa26 ^tdTomato activado...

Discussão

Devido às limitações tecnológicas, é sempre difícil de investigar o comportamento de células in vivo. No entanto, a técnica de linhagem celular de rastreamento está provando ser uma ferramenta poderosa para estudar biologia celular ^7-9. Neste estudo, nós melhorar ainda mais este protocolo, combinando-a com a imunofluorescência. Deste modo, o destino da célula pode ser definido por vários marcadores relacionados, que alarga a aplicação do rastreio linhagem. Além disso, esta co-localiza...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS