Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Resumen

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Resumen

Células madre embrionarias de ratón (CES) aislados a partir de la masa interna del blastocisto (típicamente al día E3.5), se pueden utilizar como sistema de modelo in vitro para estudiar el desarrollo embrionario temprano. En ausencia de factor inhibidor de leucemia (LIF), CES diferencian por defecto en las células precursoras neurales. Pueden ser amasaron en una de tres dimensiones (3D) agregada esférica denomina cuerpo embrioides (EB), debido a su similitud con el embrión etapa temprana. EBs se pueden sembrar en cubreobjetos recubiertos de fibronectina, donde se expanden por el crecimiento de dos extensiones (2D) dimensionales, o implantados en matrices de colágeno 3D donde continúan creciendo como esferoides, y se diferencian en las tres capas germinales: endodérmico, mesodérmico y ectodérmico. El cultivo de colágeno 3D imita el entorno in vivo más de cerca que la EBs 2D. El cultivo 2D EB facilita el análisis por inmunofluorescencia e inmunotransferencia para rastrear la diferenciación. Hemos desarrollado una diferenciación neuronal de dos pasosprotocolo ción. En el primer paso, EBs son generados por la técnica de gota colgante, y, simultáneamente, son inducidas a diferenciarse mediante la exposición a ácido retinoico (RA). En el segundo paso, la diferenciación neural avanza en un formato 2D o 3D en ausencia de AR.

Introducción

CES se originan a partir de la masa celular interna del blastocisto. Estas células son pluripotentes, es decir, tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula del organismo de origen. CES diferenciación in vitro es de gran interés como un sistema experimental para la investigación de las vías y mecanismos de desarrollo. Ofrece un modelo de sistema potente y flexible para probar nuevos enfoques terapéuticos para la corrección de la disfunción de las células y los tejidos. EB recapitulan muchos aspectos de la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana. En particular, EBs se pueden utilizar cuando la letalidad embrionaria hace que sea difícil determinar la base celular de los defectos embrionarios ^{1, 2.} EBs pueden formarse ya sea por la gota colgante o técnicas de suspensión líquido ^3. La ventaja de la primera es la capacidad de generar EBs de tamaño uniforme y la densidad, facilitando así la reproducibilidad experimental.

Interacción con proteínas de adhesión de la matriz extracelular (ECM) puede afectar la motilidad y supervivencia de las células adherentes. En el sistema de cultivo 2D, la fibronectina se aplica a menudo para aumentar la adhesión de células al sustrato. La fibronectina es un componente de lámina basal reconocido por 10 tipos de superficie celular de integrina heterodímeros ^4.

RA es un pequeño metabolito lipófilo de vitamina A que induce la diferenciación neural ^{5, 6.} Las altas concentraciones de RA promueven la expresión génica neural y reprime la expresión de genes mesodérmico durante la formación de EB ^{7, 8.} RA es producida por la vitamina A oxidación para retinaldehido por alcohol o retinol deshidrogenasa, seguido de oxidación retinaldehido al producto final por retinaldehido deshidrogenasa ^9. diferenciación neural requiere transporte de RA desde el citoplasma al núcleo por celular proteína de unión a RA-2 (CRABP2). En el núcleo, RA se une a su complejo receptor cognado que consiste en un heterodímero RAR-RXR ^10. Esto da como resultado el reclutamiento de co-transcripcional activadores, y la iniciación de la transcripción ^{9, 11.} Además, RA promueve la degradación de fosforilados (activo) Smad1, antagonizando así BMP y SMAD de señalización ^12. Además de estas actividades, RA aumenta la expresión de Pax6, un factor de transcripción que apoya la diferenciación neural ^13. Señalización RA es modulada por sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleótido de nicotinamida y adenina nuclear (NAD +) - enzima dependiente que deacetylates CRABP2, interfiriendo con su translocación al núcleo, y por lo tanto con RA de unión al heterodímero RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> Nuestro objetivo en el diseño del protocolo de EB tratado con RA se describe aquí es optimizar la diferenciación neuronal con el fin de facilitar el análisis in vitro de las vías de señalización que regulan la diferenciación ESC en células precursoras neuronales. Una de las ventajas de este protocolo es la facilitación de el análisis de la función celular por inmunofluorescencia. EBs 3D no están bien penetrada por anticuerpos y son difíciles de imagen. EB disociación en una monocapa 2D en puntos de tiempo específicos durante la diferenciación neural facilita immunolabeling y de formación de imágenes de las células por microscopía confocal.

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Protocolo

1. Cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)

1. Preparar medio MEF, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, alta glucosa), suplementado con suero de 15% de bovino fetal (FBS).
2. Coat placas de cultivo celular de 100 mm con solución de gelatina al 0,5% durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
3. Contar MEF utilizando un citómetro. Eliminar la solución de gelatina y se vierte inmediatamente medio MEF pre-calentado a 37 ° C. Rápidamente descongelar viales de mitomicina C MEFs tratadas en un baño de agua a 37 ° durante 2 min, a continuación, las semillas de 2,8 x 10 ⁶ MEFs por placa de 100 mm recubierta con gelatina. Ajustar el número de células en consecuencia si el uso de platos de otros tamaños. Incubar MEFs durante la noche a 37 ° C, 5% de _CO2.
4. Cambiar el medio en el día siguiente. Cultura durante 2-3 días hasta que la capa MEF es confluente.

2. Ratón ESC Cultura

1. Preparar medio ESC, medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con 15% de FBS y 103 U / ml de factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 55 mM 2-mercaptoetanol, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml), gentamicina (200 mg / ml), y 0,2% antibiótico micoplasma.
2. Eliminar el medio MEF de la cápsula preparada en el paso 1 y reemplazar con 37 ° medio ESC C pre-calentado.
3. Descongelar un vial de ESC y las células de semillas en la parte superior de la capa de MEF. Incubar a 37 ° C, 5% de CO _2, hasta que los CES alcanzan la confluencia.
4. Preparar nuevas placas de cultivo celular que contienen una monocapa confluente de MEFs. Para el paso de la CES, lavar una vez con PBS y separar con 0,25% de tripsina / EDTA durante 2-5 min a 37 ° C, 5% de _CO2. Detener la tripsinización añadiendo IMDM fresco con 15% de FBS a las células de desprendimiento, transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml, y se centrifuga a 160 xg durante 5 min a RT.
5. Eliminar el sobrenadante, resuspender las ESC con IMDM fresco y el paso quinto de las células a cada nuevo plato recubierto de MEF; incubar hasta que las célulasllegar a confluencia (típicamente 4-5 días).

3. Retirar MEFs y CES cultivo sobre placas recubiertas con gelatina

1. Una vez SCE alcanzó la confluencia, separarlas y MEFs con 0,25% de tripsina / EDTA como en el paso 2.4, resuspender las células en IMDM fresco, la transferencia a una placa de petri bacteriológica no adhesiva, y se incuba durante 40 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. transferir cuidadosamente los CES y MEFs medio que contiene a una nueva placa recubierta con gelatina usando una pipeta de 5 ml, evitando pipeteo repetido. Las células que permanecen en las placas de Petri son los MEF, ya que los CES no se adhieren.
3. Passage los CES cada 3-4 días. Menos frecuente pases puede reducir ESC pluripotencia. No exceda el 60% de confluencia, ya que puede favorecer la diferenciación.
4. Repita los pasos 3.2-3.3 tres veces o más, según sea necesario, hasta que ya no es detectable MEFs son por un microscopio de cultivo de células, utilizando un objetivo 20X, para asegurarse de que los MEF no están presentes.
5. Verificar ESC pluripotencia comprobando ESCcultura para ver si las células forman densas colonias con morfología típica poligonal ESC (Figura 1A). Stemness célula de prueba por reacción inversa cuantitativa en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) ^17, inmunotransferencia ^17, o inmunofluorescencia de la transcripción núcleo pluripotencia factores de ¹⁷ (Figura 2).

4. Formación de EB

1. Preparar todo trans-RA-solución madre a 10 mM en DMSO, y alícuota en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga de luz-protegido. La solución es estable a -80 ° C durante hasta dos semanas. Protegerlo de la luz.
2. Trypsinize CES como en el paso 2.4; replate en IMDM fresco sin LIF, como una suspensión de una sola célula.
3. Contar las células usando un hemocitómetro, y preparar una 5 x 10 ⁵ células / ml de suspensión en IMDM con 0,5 RA M.
4. Plate 100 20-mu L-gotas por 100 mm de placa de petri con una pipeta de 8 canales y 200 consejos mu l, invertirlos platos, y llenar la tapa invertida con PBS para impedir que las gotas que cuelgan de secado. Proteger los medios de cultivo que contiene la AR-de la luz.
5. Cultura EBs en colgante gotas a 37 ° C, 5% de _CO2, durante 4 días.

5. 2D EB Cultura

1. Coat 12 mm cubreobjetos de vidrio circular con 30 g / ml de fibronectina durante 30 min a RT. Colocar cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos, y se añade 1 ml de IMDM por pocillo.
2. Harvest 3 días-crecido colgando EBs gota una por una con 200 consejos l de pipeta y semilla de ellos en los cubreobjetos recubiertos de fibronectina, 20 EBs por pocillo, usando las mismas puntas de pipeta.
   NOTA: 3 días de EBS son preferibles a los CE de 4 días, ya que se adhieren mejor a los cubreobjetos.
3. Continuar cultivo con IMDM-15% de FBS sin LIF. Reemplazar medio cada 3-4 días. Recoger el medio utilizado para el análisis de la secreción de proteínas según sea necesario.

6. Detección de proteínas secretadas

1. Transferir 500 l de EB medium a 10 filtros centrífugos kDa-corte, centrifugado a 20.000 xg durante 60 min a 4 ° C.
2. Examine el medio que queda dentro de los filtros centrífugos cada 15-20 minutos para evitar el enriquecimiento excesivo. Detener la centrifugación cuando el volumen del medio restante ha caído a 25 l.
3. Recoger el medio concentrado restante después de invertir el filtro y girando a 160 xga 4 ° C, siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Detectar las proteínas secretadas por inmunotransferencia con anticuerpos específicos ^17.

7. Cultura EB 3D

1. Recoge los EBs cultivadas durante 4 días en colgando gotas como se describe en el paso 5.2, y colocarlos en tubos de 1,5 mL de centrífuga (30 EBS por tubo).
2. Preparar la solución de gel de colágeno siguiendo las instrucciones del kit de cultivo de colágeno 3D (véase Materiales / Tabla Equipment). Diluir volúmenes apropiados de solución de colágeno y 5x DMEM (un componente del kit); añadir el nsolución eutralization (un componente del kit) y mezclar bien inmediatamente, y mantener este en hielo.
3. Pipeta de un volumen apropiado de solución de colágeno refrigerada en el tubo de 1,5 ml que contiene el EBs, y transferir suavemente a los pocillos de una placa de 6 pocillos usando una punta de pipeta de 1 ml. Evitar hacer burbujas.
4. Inmediatamente transferir la placa a 37 ° C, 5% de _CO2, durante 60 minutos para iniciar la polimerización de colágeno.
5. Superposición de la placa de EB que contiene con IMDM.
6. Cambio de medio cada 3-4 días.

8. EB disociación

1. Recoger el día 4 EBs (del paso 4), uno por uno, con 200 consejos l de pipeta y transferirlos a una placa de petri bacteriológica no adhesiva que contiene IMDM con 15% de FBS; cultivo a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 4 días más. Compruebe el EBS dos veces al día para asegurarse de que no se adhieren a la parte inferior; agitar suavemente el plato para evitar EB fijación a la parte inferior.
2. Centrifugar los EBs a 185 xg durante 5 min aRT, en una centrífuga de sobremesa.
3. Retire los sobrenadantes. El sedimento no debe exceder de 100! L en cada tubo.
4. Añadir a sedimentaron EBs 1 ml Tipo de 0,25% I colagenasa por tubo, suplementado con 20% FBS en PBS.
5. Incubar la mezcla EB-colagenasa durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO _2, pipeteando suavemente cada 20 min, usando 1 ml puntas de pipeta.
6. Lavar las células suavemente 3x con PBS. Si los agregados de células están presentes, utilizar un filtro de células con una malla de 100 micras para eliminarlos.
7. Replate las células en un platos recubiertos de gelatina 60 mm de IMDM. Entonces se incuba a 37 ° C, 5% de _CO2.

9. La transfección de disociada EBs

1. Para qRT-PCR e inmunotransferencia, recubrir una placa de 6 pocillos con 0,5% de gelatina.
2. Por inmunofluorescencia, cubreobjetos de vidrio de la capa con 30 g / ml de fibronectina durante 30 min a RT. Colocar cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Añadir IMDM.
3. Seed 4,75 x 10 ⁵ o 1 x 10 ⁵ disociadas EB células (pasos 8.4 a 8.7) por pocillo en 6 ó 24 pocillos, respectivamente.
4. Cultivar las células a 70% de confluencia antes de la transfección.
5. Transfectar las células por un no liposómica lípido reactivo de células madre-óptima ¹⁷ (véase Materiales / Tabla Equipo), siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: El reactivo se utilizó típicamente alcanzó una eficiencia de transfección del 50% (ver resultados representativos).
6. Analizar las muestras por qRT-PCR o por inmunotransferencia ¹⁷ 2 o 3 días después de la transfección, respectivamente.

10. Análisis de EB Diferenciación por inmunofluorescencia

1. Wash EBs 2D o disociado EBs 3D con PBS y se fijan con paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 min a TA. Lavar las células fijadas 3x con PBS para eliminar los restos celulares flotante.
   NOTA: El paraformaldehido es un irritante de la piel y los ojos; tenga cuidado en su manipulación.
2. Añadir 1% de Triton X-100 en PBS para permeabilizar las células durante 20 minutos a RT, a continuación, lavar 3 veces con PBS.
3. Retirar PBS y bloquear con BSA al 5% en PBS durante 30 min.
4. Prepare dilución de anticuerpo primario en 1% BSA / PBS suplementado con 0,03% de Triton X-100. Reemplazar la solución de bloqueo por la solución de anticuerpo primario. Incubar durante 3 h a TA, o durante la noche a 4 ° C, a continuación, se lavan las células 3 veces con PBS.
5. Aplicar anticuerpo secundario en PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar durante 1 hora a RT, a continuación, se lavan las células 3 veces con PBS.
6. Monte cubreobjetos en placas de vidrio con un medio anti-fade para microscopía óptica.

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Resultados

Oct4, Nanog, y Sox2 son los factores de transcripción básicos que confieren ESC auto-renovación y pluripotencia. Se aplicó el protocolo anterior para comparar la diferenciación neural de las ESC de tipo salvaje y de una cepa de ratones modificados genéticamente donde Syx, un gen que codifica para el factor de intercambio específico de RhoA Syx, se interrumpe. Habíamos implicados en la angiogénesis Syx ^18. Nos dimos cuenta de las diferencias en lo...

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Discusión

En este protocolo se presenta un método relativamente simple y accesible para estudiar la diferenciación neuronal de los CES murinos. En los protocolos anteriores, RA se añadió al medio a día 2 o el día 4 del EB de gota colgante ⁸ o por cultivo en suspensión ^7, respectivamente, o inmediatamente después de la EB colgando agregación gota ^21. En el protocolo ideamos, RA se añadió antes. A pesar de la introducción anterior de RA a EBs formad...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging