L'analyse des rétinoïque induite par l'acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Résumé

Nous décrivons une technique pour l'utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l'acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

Résumé

Souris des cellules souches embryonnaires (CSE) isolées de la masse interne du blastocyste (typiquement à E3.5 jour), peut être utilisé comme système modèle in vitro pour étudier le développement embryonnaire précoce. En l'absence de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), CES différencient par défaut dans les cellules précurseurs neurales. Ils peuvent être amassés dans un agrégat sphérique en trois dimensions (3D) appelé corps embryoïdes (EB) en raison de sa similitude avec l'embryon à un stade précoce. EB peuvent être ensemencées sur des lamelles revêtues de fibronectine, où ils se détendent en cultivant deux extensions dimensions (2D), ou implantés dans des matrices de collagène 3D où ils continuent de plus en plus sous forme de sphéroïdes, et se différencient en trois couches germinales: endodermique, mésodermique et ectodermique. La culture de collagène 3D imite l'environnement in vivo plus près que la 2D SRU. La culture 2D EB facilite l'analyse par immunofluorescence et immunoblot pour suivre la différenciation. Nous avons développé une differentia neuronale en deux étapesProtocole de tion. Dans la première étape, EBS sont générées par la technique de la goutte suspendue, et, simultanément, sont induites à se différencier par l'exposition à l'acide rétinoïque (RA). Dans la seconde étape, le produit de différenciation de neurones dans un format 2D ou 3D, en l'absence de RA.

Introduction

Proviennent de la CES masse cellulaire interne blastocyste. Ces cellules sont pluripotentes, à savoir qu'ils ont la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule de l'organisme d'origine. ESC différenciation in vitro est d' un grand intérêt en tant que système expérimental pour étudier les voies de développement et les mécanismes. Il offre un système de modèle puissant et flexible pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la correction du dysfonctionnement des cellules et des tissus. Récapitulent de nombreux aspects EBs de la différenciation cellulaire au cours de l'embryogenèse précoce. En particulier EbS peuvent être utilisés lorsque l' embryon rend la létalité difficile de déterminer la base cellulaire des défauts embryonnaires ^{1, 2.} EB peuvent être formés soit par des techniques de suspension goutte suspendue ou liquides ^3. L'avantage de la première est la capacité de générer des EBs de taille uniforme et de densité, facilitant ainsi la reproductibilité expérimentale.

L'interaction avec les protéines d'adhésion matrice extracellulaire (ECM) peut affecter la motilité et la survie des cellules adhérentes. Dans le système de culture 2D, la fibronectine est souvent appliquée pour augmenter l'adhérence des cellules au substrat. La fibronectine est un composant de membrane basale reconnu par 10 types de surface cellulaire hétérodimères d' intégrines ^4.

RA est un petit métabolite lipophile de la vitamine A qui induit la différenciation des neurones ^{5, 6.} De fortes concentrations de RA favorisent l' expression du gène de neurones et réprime l' expression du gène mésodermique pendant la formation EB ^{7, 8.} RA est produite par oxydation de la vitamine A rétinaldéhyde soit par l'alcool déshydrogénase ou rétinol, suivie d' une oxydation de rétinaldéhyde pour le produit final par le rétinaldéhyde déshydrogénase ^9. différenciation neurale nécessite le transport de la PR du cytoplasme au noyau par la protéine de liaison cellulaire RA-2 (CRABP2). Dans le noyau, RA se lie à son récepteur apparenté complexe consistant en un hétérodimère RAR-RXR ^10. Cela se traduit par le recrutement de co-activateurs de transcription et l'initiation de la transcription ^{9, 11.} En outre, RA favorise la dégradation de phosphorylé (active) SMAD1, ainsi antagoniser la signalisation BMP et SMAD ^12. En plus de ces activités, RA augmente l' expression de Pax6, un facteur de transcription qui favorise la différenciation des neurones ^13. La signalisation de la PR est modulée par sirtuines-1 (Sirt1), une nicotinamide adénine dinucléotide nucléaire (NAD +) - enzyme dépendante qui désacétyle CRABP2, en interférant avec sa translocation vers le noyau, et donc avec RA liaison à l'hétérodimère RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> Notre objectif dans la conception du protocole EB-traité RA décrit ici est d'optimiser la différenciation neuronale afin de faciliter l' analyse in vitro des voies de signalisation qui régulent la différenciation ESC dans les cellules précurseurs neuronaux. L' un des avantages de ce protocole est la facilitation de l'analyse de la fonction des cellules par immunofluorescence. 3D EB ne sont pas bien pénétré par les anticorps et sont difficiles à image. dissociation EB dans une monocouche 2D à des moments spécifiques au cours de la différenciation neuronale facilite l'immunomarquage et l'imagerie des cellules par microscopie confocale.

Protocole

1. La culture de fibroblastes embryonnaires de souris (FAE)

1. Préparer le milieu MEF, le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, à haute glucose), supplémenté avec 15% de sérum de fœtus bovin (FBS).
2. Manteau de 100 mm des boîtes de culture cellulaire avec une solution de gélatine à 0,5% pendant 30 min à température ambiante (RT).
3. Count en utilisant un cytomètre FAE. Retirer la solution de gélatine et verser immédiatement milieu MEF pré-chauffé à 37 ° C. Décongeler rapidement des flacons de mitomycine C-MEF traitée dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 min, puis ensemencer 2,8 x 10 ⁶ par MEF 100 mm plat revêtues de gélatine. Régler le nombre de cellules en conséquence si vous utilisez des plats d'autres tailles. Incuber MEFs nuit à 37 ° C, 5% CO _2.
4. Changer le support le lendemain. Culture pendant 2-3 jours jusqu'à ce que la couche MEF est confluentes.

2. Souris ESC Culture

1. Préparer complété avec 15% de FBS et 10 milieu ESC, modifié le milieu de Dulbecco d'Iscove (IMDM)3 facteur inhibiteur de la leucémie U / mL (LIF), 0,1 mM d' acides aminés non essentiels, 55 mM de 2-mercaptoéthanol, de la pénicilline (100 U / ml), de la streptomycine (100 ug / ml), de la gentamicine (200 pg / ml) et 0,2% antibiotique mycoplasmes.
2. Retirer le milieu MEF du plat préparé à l'étape 1 et le remplacer par 37 ° C préchauffé moyen ESC.
3. Décongeler un flacon ESC et les cellules de semence au-dessus de la couche MEF. Incuber à 37 ° C, 5% CO _2, jusqu'à ce que les CES atteignent la confluence.
4. Préparer de nouvelles boîtes de culture cellulaire contenant une monocouche confluente de FAE. Pour le passage CES, laver une fois avec du PBS et on détache avec 0,25% de trypsine / EDTA pendant 2 à 5 min à 37 ° C, 5% CO _2. Arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant fraîche IMDM avec 15% de FBS pour les cellules de détachement, transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml, et centrifuger à 160 g pendant 5 min à température ambiante.
5. Retirer le surnageant, remettre en suspension avec de CES IMDM frais et un cinquième passage des cellules à chaque nouveau plat revêtu MEF; incuber jusqu'à ce que les cellulesatteindre la confluence (habituellement 4-5 jours).

3. Prélever et culture FAE sur des plaques CES enduits Gélatine

1. Une fois CEMA a atteint la confluence, détacher les et MEF avec 0,25% de trypsine / EDTA comme dans l'étape 2.4, remettre en suspension les cellules dans du milieu IMDM frais, le transfert à une boîte de Petri bactériologiques non-adhésif, et incuber pendant 40 min à 37 ° C, 5% CO _2.
2. transférer soigneusement CES et MEF milieu contenant une nouvelle plaque revêtue de gélatine à l'aide d'une pipette de 5 ml, en évitant pipetage répété. Les cellules restantes dans les boîtes de Pétri sont FAE, car ne respectent pas les CES.
3. Passage les 3-4 jours tous les CES. Moins fréquents passages peut réduire ESC pluripotence. Ne pas dépasser la confluence de 60%, car il peut favoriser la différenciation.
4. Répétez les étapes 3.2-3.3 trois fois ou plus, au besoin, jusqu'à ce que les FAE ne sont plus détectables par un microscope de culture cellulaire, en utilisant un objectif 20X, de faire MEFs sûr ne sont pas présents.
5. Vérifiez ESC pluripotence en vérifiant ESCculture pour voir si les cellules forment des colonies denses ayant une morphologie polygonale ESC typique (Figure 1A). Stemness de cellule de test par réaction en chaîne de la polymérase de la transcriptase inverse quantitative (qRT-PCR) ^{17, 17} immunotransfert ou immunofluorescence de la transcription de la pluripotence de base des facteurs ¹⁷ (Figure 2).

4. Formation EB

1. Préparer tout-trans-RA solution mère à 10 mM dans le DMSO, et aliquote dans 1,5 ml microtubes de protection de lumière. La solution est stable à -80 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Protéger de la lumière.
2. Trypsiniser CES que dans l'étape 2.4; replate dans IMDM frais sans LIF, comme une suspension à cellule unique.
3. Compter les cellules à l' aide d' un hémocytomètre, et de préparer une suspension de 5 x 10 ⁵ cellules / ml dans IMDM avec 0,5 uM de RA.
4. Plate 100 20 ul de gouttes par boîte de Pétri de 100 mm avec une pipette à 8 canaux et 200 uL de conseil, inverserles plats, et de remplir le couvercle renversé avec du PBS pour éviter que des gouttes suspendues de séchage. Protéger les milieux de culture contenant de la PR de la lumière.
5. Culture EBs en accrochant des gouttes à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 4 jours.

5. 2D EB Culture

1. Manteau de 12 mm des lamelles en verre circulaire avec 30 ug / ml de fibronectine pendant 30 min à température ambiante. Placez chaque lamelle dans un puits d'une plaque de 24 puits et ajouter 1 ml IMDM par puits.
2. Récolte 3 goutte suspendue adulte jour un par un EBs avec 200 ul embouts de pipette et les graines sur les lamelles revêtues de fibronectine, 20 par puits ballasts électroniques, en utilisant les mêmes embouts de pipette.
   NOTE: 3 jours EBs sont préférables à 4 jours EBs parce qu'ils adhèrent mieux aux lamelles.
3. Continuer avec la culture IMDM-15% FBS sans LIF. Remplacez moyenne tous les 3-4 jours. Recueillir le moyen utilisé pour l'analyse de la sécrétion de la protéine au besoin.

6. La détection des protéines sécrétées

1. Transfert 500 pi de EB medium à filtres centrifuges 10 kDa, d'arrêt de rotation à 20 000 xg pendant 60 min à 4 ° C.
2. Examinez le milieu restant à l'intérieur des filtres centrifuges toutes les 15-20 minutes pour éviter un enrichissement excessif. Arrêt centrifugation lorsque le volume du milieu restant est tombé à 25 pi.
3. Recueillir le milieu concentré restant après l'inversion du filtre et centrifugation à 160 xg à 4 ° C, en suivant les instructions du fabricant.
4. Détecter les protéines sécrétées par immunotransfert avec des anticorps spécifiques ^17.

7. Culture 3D EB

1. Recueillir les EBs cultivées pendant 4 jours en gouttes pendantes comme décrit à l'étape 5.2, et les placer dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 ml (30 ebs par tube).
2. Préparer la solution de gel de collagène en suivant les instructions du kit de culture de collagène 3D (voir Matériaux / Matériel Table). Diluer volumes appropriés de solution de collagène et 5x DMEM (un composant du kit); ajouter le nsolution eutralization (un composant du kit) et bien mélanger immédiatement et garder ce sur la glace.
3. Pipeter un volume approprié de solution de collagène froide dans le tube de 1,5 ml contenant l'EBS, et le transfert en douceur pour les puits d'une plaque à 6 puits en utilisant une pipette de 1 ml. Évitez de faire des bulles.
4. Transférer immédiatement la plaque à 37 ° C, 5% de CO _2, pendant 60 minutes pour initier la polymérisation du collagène.
5. Superposer la plaque contenant de l'IMDM avec EB.
6. Changer moyenne tous les 3-4 jours.

8. EB Dissociation

1. Recueillir le jour 4 EB (de l'étape 4) une par une, avec 200 uL embouts de pipette et les transférer sur une boîte de Petri bactériologiques non adhésive contenant de l'IMDM avec 15% de FBS; culture à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 4 jours supplémentaires . Vérifiez la deux fois par jour EBs pour vous assurer qu'ils ne se fixent pas au fond; doucement secouer la cuvette pour empêcher la fixation EB vers le bas.
2. Centrifuger les EB à 185 xg pendant 5 min àRT, dans une centrifugeuse de paillasse.
3. Retirez les surnageants. Le culot ne doit pas dépasser 100 pi dans chaque tube.
4. Ajouter à granulés EB 1 ml de type I à 0,25% de collagénase par tube, complété avec 20% de FBS dans du PBS.
5. Incuber le mélange EB-collagénase pendant 1 h à 37 ° C, 5% CO _2, pipetant doucement toutes les 20 minutes, en utilisant 1 mL embouts de pipette.
6. Laver les cellules doucement 3x avec du PBS. Si les agrégats de cellules sont présentes, utiliser un tamis cellulaire avec un maillage de 100 um pour les supprimer.
7. Réensemencement les cellules sur des plats de 60 mm revêtues de gélatine dans de l'IMDM. Puis incuber à 37 ° C, 5% CO _2.

9. Transfection de dissociées EBs

1. Pour qRT-PCR et immunotransfert, un manteau de plaque à 6 puits avec 0,5% de gélatine.
2. Par immunofluorescence, des lamelles de verre d'enveloppe avec 30 ug / ml de fibronectine pendant 30 min à température ambiante. Placez chaque lamelle dans un puits d'une plaque de 24 puits. Ajouter IMDM.
3. Graine 4,75 x 10 ⁵ ou 1 x 10 ⁵ dissociées les cellules EB (étapes 8/4 à 8/7) par puits en 6 ou plaques à 24 puits, respectivement.
4. Cultiver les cellules à 70% de confluence avant la transfection.
5. Transfecter les cellules par un réactif de cellules souches optimales lipide nonliposomal ¹⁷ (voir Matériaux / Matériel Table), en suivant les instructions du fabricant.
   NOTE: Le réactif que nous avons utilisé généralement atteint un rendement de transfection de 50% (voir résultats représentatifs).
6. Analyser les échantillons par qRT-PCR ou par immunotransfert ¹⁷ 2 ou 3 jours après la transfection, respectivement.

10. L'analyse de Différenciation EB par immunofluorescence

1. Laver 2D EB ou EB 3D dissocié avec du PBS et fixer avec 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min à température ambiante. Laver les cellules fixées 3x avec du PBS pour éliminer les débris cellulaires flottant.
   NOTE: Le paraformaldéhyde est un irritant pour la peau et les yeux; soyez prudent lors de la manipulation.
2. Ajouter 1% triton X-100 dans du PBS pour perméabiliser les cellules pendant 20 minutes à la température ambiante, puis laver 3 fois avec du PBS.
3. Retirer le PBS et bloquer avec 5% de BSA dans du PBS pendant 30 min.
4. Préparer une dilution de l'anticorps primaire dans 1% de BSA / PBS additionné de 0,03% de triton X-100. Remplacer la solution de blocage par la solution d'anticorps primaire. Incuber pendant 3 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C, puis laver les cellules 3 fois avec du PBS.
5. Appliquer l'anticorps secondaire dans du PBS selon les instructions du fabricant. Incuber pendant 1 h à TA, puis laver les cellules 3 fois avec du PBS.
6. Mont de lamelles de verre sur des lames avec un milieu anti-fade pour la microscopie optique.

Résultats

Oct4, Nanog, et SOX2 sont les facteurs de transcription de base qui confèrent ESC auto-renouvellement et la pluripotence. Nous avons appliqué le protocole ci - dessus pour comparer la différenciation neuronale des CES de type sauvage et d'une souche de souris génétiquement modifiées où Syx, un gène codant pour le facteur d'échange spécifique de RhoA Syx, est perturbé. Nous avions impliqués dans l' angiogenèse Syx ^18. Nous avons re...

Discussion

Dans ce protocole, nous présentons une méthode relativement simple et accessible pour étudier la différenciation neuronale des souris CES. Dans les protocoles précédents, RA a été ajouté au milieu au jour 2 ou 4 jours de la tenture-drop EB ⁸ ou par culture en suspension ^7, respectivement, ou immédiatement après l'agrégation goutte suspendue EB ^21. Dans le protocole que nous avons conçu, RA a été ajouté plus tôt. En dépit de la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging