Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Resumo

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Resumo

De ratinho de células estaminais embrionárias (CES) isolados a partir da massa interna do blastocisto (tipicamente no dia E3.5), pode ser utilizado como sistema modelo in vitro para estudar o desenvolvimento embrionário precoce. Na ausência de factor inibidor de leucemia (LIF), CES diferenciar pelo padrão para as células precursoras neurais. Eles podem ser acumulados num tridimensional (3D) agregado esférico denominado corpo embrióides (EB), devido à sua semelhança com o embrião em fase precoce. EBs podem ser semeadas em lamelas revestidas com fibronectina, onde eles se expandem através do crescimento duas extensões dimensionais (2D), ou implantado em matrizes de colagénio 3D, onde eles continuar a crescer como esferóides, e diferenciam-se em três camadas germinais: endoderme, mesoderme, e ectodérmica. A cultura de colagénio 3D imita o ambiente in vivo mais perto do que a EB 2D. A cultura 2D EB facilita a análise por imunofluorescência e imunotransferência para controlar a diferenciação. Nós desenvolvemos uma diferenciação neural de duas etapasprotocolo ção. No primeiro passo, EBs são gerados pela técnica de suspensão-gota, e, simultaneamente, são induzidos a diferenciar por exposição ao ácido retinóico (RA). No segundo passo, os rendimentos de diferenciação de células neurais em formato 2D ou 3D, na ausência de RA.

Introdução

CES originam a partir da massa celular interior de blastocistos. Estas células são pluripotentes, isto é, têm a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de células do organismo de origem. CES diferenciação in vitro é de grande interesse como um sistema experimental para a investigação de vias e de mecanismos de desenvolvimento. Dispõe de um sistema modelo potente e flexível para testar novas abordagens terapêuticas para a correcção da disfunção de células e tecidos. EBs recapitular diversos aspectos da diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário precoce. Em particular, a EBS pode ser utilizado quando a letalidade embrionária torna difícil determinar a base celular dos defeitos embrionárias ^{1, 2.} EBs pode ser formada quer por as gotas de suspensão ou técnicas de suspensão líquidos ^3. A vantagem da primeira é a capacidade de gerar EBs de tamanho e densidade consistente, facilitando assim a reprodutibilidade experimental.

A interacção com proteínas de adesão da matriz extracelular (ECM) podem afectar a motilidade e a sobrevivência de células aderentes. No sistema de cultura de 2D, a fibronectina é muitas vezes aplicada para aumentar a adesão de células ao substrato. A fibronectina é uma componente de lâmina basal reconhecido por 10 tipos de superfície celular das integrinas heterodímeros ^4.

RA é um metabolito lipófilo pequeno de vitamina A que induz a diferenciação neuronal ^{5, 6.} Elevadas concentrações de RA promover a expressão do gene neural e reprime a expressão do gene durante mesodérmica EB formação ^{7, 8.} RA é produzido pela oxidação de vitamina A para Retinaldeído por qualquer álcool ou retinol desidrogenase, seguido por oxidação retinaldeído para o produto final por retinaldeído desidrogenase ^9. diferenciação neural requer o transporte de RA a partir do citoplasma para o núcleo através da proteína de ligação celular RA 2 (CRABP2). No núcleo, RA se liga ao seu receptor cognato complexo consistindo de um heterodímero de RAR-RXR ^10. Isto resulta em recrutamento de co-activadores da transcrição, e a iniciação da transcrição ^{9, 11.} Além disso, RA promove a degradação de fosforilada (activa) Smad1, antagonizando assim BMP e sinalização SMAD ^12. Além destas actividades, AR aumenta a expressão Pax6, um factor de transcrição que suporta diferenciação neural ^13. Sinalização RA é modulada por sirtuina-1 (Sirt1), um dinucleótido adenina nicotinamida nuclear (NAD +) - enzima dependente que deacetylates CRABP2, interferindo com a sua translocação para o núcleo e, consequentemente, com a ligação do AR para o heterodímero RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> A nossa meta na concepção do protocolo EB-tratada RA descrito aqui é para optimizar a diferenciação neuronal, a fim de facilitar a análise in vitro das vias de sinalização que regulam a diferenciação CES em células precursoras neuronais Uma das vantagens deste protocolo. é facilitação de a análise da função das células por imunofluorescência. 3D EB não são bem penetrado por anticorpos e são difíceis de imagem. EB dissociação em uma monocamada 2D em pontos de tempo específicos durante a diferenciação neuronal e facilita a imunomarcação de imagem das células por microscopia confocal.

Protocolo

1. Cultura de rato embrionárias fibroblastos (MEFs)

1. Preparar o meio MEF, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, rico em glicose), suplementado com soro a 15% de bovino fetal (FBS).
2. O revestimento 100 mm pratos de cultura de células com solução de gelatina a 0,5% durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
3. Contagem MEFs usando um citômetro. Remover a solução de gelatina e verter imediatamente meio MEF pré-aquecido a 37 ° C. Descongelar rapidamente frasquinhos de mitomicina-C MEFs tratada num banho de água a 37 ° C durante 2 min, em seguida, propagar 2,8 x 10 ⁶ por placa MEFs revestido com gelatina de 100 mm. Ajustar em conformidade o número de células se usando pratos de outros tamanhos. Incubar MEFs a noite a 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Mudar o meio no dia seguinte. Cultura durante 2-3 dias até a camada MEF é confluente.

2. Rato Cultura ESC

1. Preparar o meio CES, meio modificado Iscove da Dulbecco (IMDM) suplementado com 15% de FBS e 103 U / ml de factor inibidor da leucemia (LIF), mM de aminoácidos não essenciais 0,1, 55 mM de 2-mercaptoetanol, penicilina (100 U / mL), estreptomicina (100 ug / ml), gentamicina (200 ug / mL), e 0,2% antibiótico micoplasma.
2. Remover o meio MEF do prato preparado no passo 1 e substitua com meio CES 37 ° C pré-aquecido.
3. Descongelar um frasco CES e células de sementes no topo da camada de MEF. Incubar a 37 ° C, 5% de _CO2, até CES alcançar confluência.
4. Prepare novos pratos de cultura de células contendo uma monocamada confluente de MEFs. Para a passagem CES, lavar uma vez com PBS e destacam com 0,25% de tripsina / EDTA durante 2-5 min a 37 ° C, 5% de CO _2. Pare a tripsinização adicionando IMDM fresco com 15% de FBS para as células de extracção transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar a 160 xg durante 5 min à TA.
5. Remover o sobrenadante, CES ressuspender com IMDM fresco e passagem de um quinto das culas a cada novo prato MEF-revestidos; incubar até que as célulasalcançar confluência (normalmente 4-5 dias).

3. Retira MEFs e CES cultura em placas revestidas com gelatina-

1. Uma vez ECSs atingiram a confluência, destacá-las e MEFs com 0,25% de tripsina / EDTA como no passo 2.4, ressuspender as células em IMDM fresco, transferidos para uma placa de Petri bacteriológicas não-adesiva, e incubar durante 40 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. transferir cuidadosamente CES e MEFs contendo meio para uma nova placa revestida com gelatina usando uma pipeta de 5 ml, evitando pipetagem repetida. As células restantes nas placas de petri são MEFs, já que os CES não aderem.
3. Passage os CES cada 3-4 dias. Menos frequente passagem pode reduzir CES pluripotência. Não exceda os 60% de confluência, pois pode favorecer a diferenciação.
4. Repita os passos de 3,2-3,3 três vezes ou mais, conforme necessário, até MEFs não detectável são, por um microscópio de cultura de células, usando uma objetiva de 20X, para certificar-se MEFs não estão presentes.
5. Verifique ESC pluripotência, verificando ESCcultura para ver se as células formam colónias densas com morfologia típica poligonal CES (Figura 1A). Stemness célula de ensaio por reacção inversa quantitativa em cadeia transcriptase-polimerase (qRT-PCR) ^{17, 17?} Immunoblotting, ou imunofluorescência de transcrição núcleo pluripotência factores ¹⁷ (Figura 2).

4. Formação EB

1. Prepare all-trans-RA solução estoque a 10 mM em DMSO, e alíquota de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga-protegido da luz. A solução é estável a -80 ° C durante até duas semanas. Proteger da luz.
2. Tripsinizar CES como no passo 2.4; replate em IMDM fresco sem LIF, como uma suspensão de célula única.
3. Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e preparar uma 5 x 10 ⁵ culas suspensão / mL em IMDM com 0,5 uM RA.
4. Placa 100 20-uL-gotas por placa de petri de 100 mm com uma pipeta de 8 canais e pontas 200 ul, invertidoos pratos, e preencher a tampa invertida com PBS para evitar gotas de suspensão de secagem. Proteger os meios de cultura contendo RA de luz.
5. Cultura em suspensão EBs gotas a 37 ° C, 5% de _CO2, durante 4 dias.

5. Cultura EB 2D

1. O revestimento 12 mm lamelas de vidro circular com 30 ug / mL de fibronectina durante 30 min a RT. Colocar cada lamela em um poço de uma placa de 24 poços, e adicionar 1 mL de IMDM por poço.
2. Colheita 3 pendurado EBs gota uma por uma com 200 uL pontas de pipetas e semear-los sobre as lamelas revestidas com fibronectina, 20 EBs por poço, utilizando as mesmas pontas de pipetas crescido-dia.
   NOTA: 3 dias EBs são preferíveis sobre EBs 4 dias porque eles aderem melhor para as lamelas.
3. Continuar com a cultura IMDM-FBS a 15% sem LIF. Substitua média a cada 3-4 dias. Recolhe-se o meio utilizado para a análise de secreção de proteínas, conforme necessário.

6. Detecção de proteínas secretadas

1. Transferir 500 mL de EB medihm a 10 filtros centrífugos kDa de corte, girar a 20.000 xg durante 60 min a 4 ° C.
2. Examinar o meio restante dentro dos filtros centrífugos a cada 15-20 min para evitar o enriquecimento excessiva. Pare centrifugação, quando o volume do meio restante caiu para 25 mL.
3. Recolhe-se o meio concentrado restante após a inversão do filtro e girando a 160 xg, a 4 ° C, seguindo as instruções do fabricante.
4. Detectar as proteínas segregadas por imunotransferência com anticorpos específicos ^17.

7. Cultura EB 3D

1. Recolher os CEs cultivadas durante 4 dias na suspensão gotas, tal como descrito no passo 5.2, e colocá-los em tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 EBs por tubo).
2. Preparar a soluo de gel de colagénio, seguindo as instruções do kit de cultura 3D colagénio (ver Materiais / Equipamento Tabela). Dilui-se volumes apropriados da solução de colagénio e 5x DMEM (um componente do kit); adicione o nsolução eutralization (um componente do kit) e misturar bem imediatamente, e manter este em gelo.
3. Pipetar um volume adequado de solução de colagénio refrigerada para dentro do tubo de 1,5 mL contendo o EBS, e transferir suavemente para os poços de uma placa de 6 poços utilizando uma ponta de uma pipeta mL. Evite fazer bolhas.
4. Imediatamente transferir a placa a 37 ° C, 5% de CO _2, durante 60 minutos para iniciar a polimerização do colagénio.
5. Sobrepor a placa de EB contendo com IMDM.
6. Alterar média a cada 3-4 dias.

8. EB dissociação

1. Recolhe-se o dia 4 EB (a partir do passo 4), um por um, com 200 uL pontas de pipetas e transferi-los para um não-adesiva bacteriológica prato de petri contendo IMDM com 15% de FBS; cultura a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante mais 4 dias. Verifique a EBs duas vezes todos os dias para se certificar de que eles não dão a baixo; agite o prato para impedir a fixação EB para o fundo.
2. Centrifugar os CEs a 185 xg durante 5 min aRT, numa centrífuga de bancada.
3. Retire os sobrenadantes. A pelete não deve exceder 100 mL em cada tubo.
4. Adicionar a sedimentadas EBs 1 mL de tipo I a 0,25% colagenase por tubo, suplementado com 20% de FBS em PBS.
5. Incubar a mistura de EB com colagenase durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2, pipetando-o suavemente a cada 20 min, utilizando 1 mL de pontas de pipetas.
6. Lavam-se as culas suavemente 3x com PBS. Se os agregados de células estão presentes, usar um filtro de células com uma malha de 100? M para removê-los.
7. Replate as células em um revestidas com gelatina pratos de 60 mm em IMDM. Em seguida, incuba-se a 37 ° C, 5% de CO _2.

9. A transfecção de Dissociated EBs

1. Para qRT-PCR e imunotransferência, revestir uma placa de 6 poços com 0,5% de gelatina.
2. Para imunofluorescência, lamelas de vidro com revestimento de 30 ug / mL de fibronectina durante 30 minutos à temperatura ambiente. Colocar cada lamela em um poço de uma placa de 24 poços. Adicionar IMDM.
3. Semente de 4,75 x 10 ⁵ ou 1 x 10 ⁵ dissociadas células EB (passos 8,4-8,7) por poço em 6 ou 24 poços placas, respectivamente.
4. Crescer as células a 70% de conflucia antes da transfecção.
5. Transfectar as células por um reagente de células-tronco-óptima lípido não lipossómicos ¹⁷ (ver Materiais / Equipamento Tabela), seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: O reagente foi utilizado tipicamente alcançada uma eficiência de transfecção de 50% (ver Resultados representativos).
6. Analisar as amostras por qRT-PCR ou por imunotransferência ¹⁷ 2 ou 3 dias após a transfecção, respectivamente.

10. Análise da EB Diferenciação por imunofluorescência

1. Lavagem 2D EBs ou dissociado EBs 3D com PBS e fixar com 4% de paraformaldeo em PBS durante 30 min à TA. Lavam-se as células fixadas 3x com PBS para remover os detritos celulares flutuante.
   NOTA: O paraformaldeído é uma pele e dos olhos irritante; tenha cuidado ao manuseá-lo.
2. Adicionar 1% de triton X-100 em PBS para permeabilizar as células durante 20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lavar 3x com PBS.
3. Remover PBS e bloquear com 5% de BSA em PBS durante 30 min.
4. Prepare uma diluição de anticorpo primário em 1% de BSA / PBS suplementado com 0,03% de Triton X-100. Substituir a solução de bloqueio pela solução de anticorpo primário. Incuba-se durante 3 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C, em seguida, lavar as células 3x com PBS.
5. Aplicar anticorpo secundário em PBS de acordo com as instruções do fabricante. Incubar durante 1 h à TA, em seguida, lavar as células 3x com PBS.
6. Montagem lamelas em lâminas de vidro com um meio anti-desvanecimento para microscopia óptica.

Resultados

Oct4, Nanog, e SOX2 são os factores de transcrição nucleares que conferem CES auto-renovação e pluripotência. Aplicou-se o protocolo acima para comparar a diferenciação neuronal de CES de tipo selvagem e de uma estirpe de ratos geneticamente modificados onde Syx, um gene que codifica para o factor de troca específicas de RhoA Syx, é interrompido. Nós tinha implicado Syx na angiogênese ^18. Foram observadas diferenças nos comportamentos de EBs ...

Discussão

Neste protocolo, apresentar um método relativamente simples e acessíveis para estudar diferenciação neural dos CES murino. Em protocolos anteriores, RA foi adicionado ao meio no dia 2 ou no dia 4 do EB de gota suspensa de ⁸ ou por cultura em suspensão ^{de 7,} respectivamente, ou imediatamente depois da EB pendurado agregação gota ^21. No protocolo que concebeu, RA foi adicionado anteriormente. Apesar da introdução anterior do RA a EBs formado ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging