Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen der Maus (WSR) von der Innenmasse der Blastozyste isoliert ( in der Regel am Tag E3.5) können für die Untersuchung der frühe Embryonalentwicklung als in - vitro - Modellsystem verwendet werden. In Abwesenheit von Leukämie-Hemmfaktor (LIF), unterscheidet WSR standardmäßig in neuralen Vorläuferzellen. Sie können in einer dreidimensionalen (3D) angehäuft werden, um sphärische Aggregat bezeichnet Embryoidkörperbildung (EB) aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem frühen Stadium Embryo. EBs auf Fibronektin-beschichtete Deckgläser ausgesät werden, wo sie von wachsenden zweidimensionale (2D) Erweiterungen oder implantiert in 3D-Kollagen-Matrices erweitern, wo sie als Sphäroiden weiter wachsen und differenzieren sich in die drei Keimblätter: endodermisches, mesodermalen und ektodermalen. Die 3D - Kollagen Kultur ahmt die in - vivo - Umgebung näher als der 2D - EBs. Die 2D-EB Kultur erleichtert Analyse von Immunfluoreszenz und Immunoblotting Differenzierung zu verfolgen. Wir haben einen zweistufigen neuronalen Differenzierung entwickeltmunikationsprotokoll. Im ersten Schritt wird EBs durch die Hanging-Drop-Technik erzeugt werden, und, gleichzeitig, induziert durch Exposition gegenüber Retinsäure (RA) zu differenzieren. Im zweiten Schritt, neuronalen Differenzierung erfolgt in einem 2D- oder 3D-Format in Abwesenheit von RA.

Einleitung

WSR stammt aus der Blastozyste inneren Zellmasse. Diese Zellen sind pluripotent, dh sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung zu jedem Zelltyp des Ursprungsorganismus haben. ESC in vitro Differenzierung von breitem Interesse als experimentelles System für die Entwicklungsweg und Mechanismen zu untersuchen. Es bietet ein starkes und flexibles Modellsystem neue therapeutische Ansätze zur Korrektur von Zell- und Gewebestörungen zu testen. EBs rekapitulieren viele Aspekte der Zelldifferenzierung während der frühen Embryonalentwicklung. Insbesondere kann EBs verwendet werden , wenn embryonale Letalität erschwert es , die zellulären Grundlagen der embryonalen Defekte ^{1, 2} zu bestimmen. EBs können ³ durch den hängenden Tropfen oder flüssigen Suspensionstechniken gebildet entweder werden. Der Vorteil des ersteren ist die Fähigkeit, EBs konsistenter Größe und Dichte zu erzeugen, so dass experimentelle Reproduzierbarkeit zu erleichtern.

Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrix (ECM) Adhäsionsproteine ​​kann die Beweglichkeit und das Überleben von adhärenten Zellen beeinflussen. In dem 2D-Kultursystem wird oft Fibronektin zu erhöhen Zelladhäsion auf das Substrat aufgebracht. Fibronectin ist eine Basallamina Komponente um 10 Arten von Zelloberflächen - Integrin - Heterodimeren erkannt ^4.

RA ist ein kleines lipophiles Metabolit von Vitamin A , das ⁵ neurale Differenzierung ^{induziert, 6.} Hohe Konzentrationen von RA Förderung neuronaler Genexpression reprimiert und mesodermalen Genexpression während der EB Bildung ^{7, 8.} RA wird durch Vitamin - A - Oxidation Retinaldehyd entweder durch Alkohol oder Retinol - Dehydrogenase, gefolgt von Retinaldehyd Oxidation zum Endprodukt durch Retinaldehyd dehydrogenase ⁹ hergestellt. Neuronale Differenzierung erfordert Transport von RA aus dem Cytoplasma an den Kern durch zelluläre RA-bindendes Protein 2 (CRABP2). Im Kern bindet RA an seinen zugehörigen Rezeptor - Komplex , bestehend aus einem RAR-RXR - Heterodimer ^10. Dies führt bei der Rekrutierung von Transkriptions Co-Aktivator, und der Initiation der Transkription ^{9, 11.} Darüber hinaus fördert die RA den Abbau von phosphoryliertem (aktiv) SMAD1, wodurch BMP und SMAD Antagonisierung ¹² signalisiert. Zusätzlich zu diesen Aktivitäten erhöht RA Pax6 - Expression, einen Transkriptionsfaktor, ¹³ neuralen Differenzierung unterstützt. RA - Signalisierung moduliert durch sirtuin-1 (Sirt1), ein Kern Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) - abhängiges Enzym , die CRABP2 deacetyliert, mit seiner Translokation in den Zellkern zu stören, und damit mit RA der Bindung an den RAR-RXR - Heterodimer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Unser Ziel der RA-behandelten EB - Protokoll bei der Gestaltung hier beschriebene neuronale Differenzierung zu optimieren , um in - vitro - Analyse der Signalwege zu erleichtern , die ESC Differenzierung in Zellen neuronalen Vorläufer regulieren. Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die Erleichterung der die Analyse der Zellfunktion durch Immunofluoreszenz. 3D EBs ist gut nicht durch Antikörper durchdrungen und ist schwer zu Bild. EB Dissoziation in einen 2D-Monolayer zu bestimmten Zeitpunkt während der neuronalen Differenzierung und Immunomarkierung Bildgebung der Zellen durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.

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Protokoll

1. Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)

1. Bereiten MEF Medium, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, high-glucose), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS).
2. Coat 100 mm Zellkulturschalen mit 0,5% Gelatine-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
3. Graf MEFs mit einem Durchflusszytometer. Entfernen der Gelatinelösung und sofort gießen MEF Medium vorgewärmt auf 37 ° C. Schnell auftauen Phiolen von Mitomycin C-behandeln MEFs in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min, dann 2,8 x 10 ⁶ pro 100 mm MEFs gelatinebeschichteten dish Samens. Passen Sie die Zellzahl entsprechend, wenn Gerichte anderer Größen verwendet. Inkubieren MEFs über Nacht bei 37 ° C, 5% CO _2.
4. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag. Kultur für 2-3 Tage, bis die MEF Schicht konfluent.

2. Maus ESC Kultur

1. Bereiten ESC Medium, Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 15% FBS und 103 U / ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0,1 mM nicht - essentielle Aminosäuren, 55 mM 2-Mercaptoethanol, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml), Gentamicin (200 ug / ml) und 0,2% Mykoplasmen-Antibiotikum.
2. Entfernen MEF Medium aus der in Schritt hergestellten Schale 1 und ersetzen mit 37 ° C vorgewärmtes Medium ESC.
3. Abzutauen einen ESC Phiole und Samenzellen auf der Oberseite der Schicht MEF. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO _2, bis WSR Konfluenz erreichen.
4. Bereiten Sie neue Zellkulturschalen eine konfluente Monoschicht von MEFs enthält. In den Durchgang wäscht die WSR, einmal mit PBS und nimmt mit 0,25% Trypsin / EDTA für 2-5 min bei 37 ° C, 5% CO _2. Stoppen die Trypsinierung durch Zugabe von frischem IMDM mit 15% FBS zu den Zellen abgenommen, überträgt die Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 160 xg für 5 min bei RT.
5. Entfernen Sie den Überstand, resuspendiere WSR mit frischem IMDM und der Durchgang ein Fünftel der Zellen zu jedem neuen MEF-beschichtete Schale; brüten, bis die Zellenerreichen Einmündung (in der Regel 4-5 Tage).

3. Ziehen Sie MEFs und Kultur WSR auf Gelatine-beschichteten Platten

1. Sobald ECS Konfluenz erreicht, lösen sie und MEFs mit 0,25% Trypsin / EDTA, wie in Schritt 2.4, um die Zellen in frischen IMDM resuspendieren, Übertragung auf ein nicht haftenden bakteriologischen Petrischale gegeben und bei 37 ° C für 40 min inkubieren, 5% CO _2.
2. Sorgfältig übertragen WSR und MEFs enthaltenden Medium zu einer neuen Gelatine beschichteten Platte, die eine 5 ml-Pipette, wiederholtes Pipettieren zu vermeiden. Die Zellen in den Petrischalen verbleiben, sind MEFs, da WSR nicht haften.
3. Passage der WSR alle 3-4 Tage. Seltener Passagierung kann ESC Pluripotenz reduzieren. Nicht mehr als 60% Konfluenz überschreiten, da es die Differenzierung begünstigen kann.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,3 dreimal oder mehr, je nach Bedarf, bis MEFs nicht mehr nachweisbar ist von einer Zellkulturmikroskop, ein 20x-Objektiv verwendet wird, sicher MEFs zu machen, ist nicht vorhanden.
5. Überprüfen Sie ESC Pluripotenz von ESC ÜberprüfungKultur zu sehen , ob die Zellen dichte Kolonien mit typischer ESC polygonaler Morphologie (Abbildung 1A) bilden. Prüfzelle stemness durch quantitative reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) ^{17, 17} Immunoblotting oder Immunofluoreszenz von Kern Pluripotenz Transkriptionsfaktoren ¹⁷ (Abbildung 2).

4. EB Bildung

1. Bereiten all-trans-RA-Stammlösung auf 10 mM in DMSO und 1,5 ml Aliquot in lichtgeschützte Microfuge-Röhrchen. Die Lösung ist stabil bei -80 ° C für bis zu zwei Wochen. Schützen Sie es vor Licht.
2. Trypsinisieren WSR wie in Schritt 2.4; Ausstrich in frischem IMDM ohne LIF als Einzelzellsuspension.
3. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten eine 5 x 10 ⁵ Zellen / ml - Suspension in IMDM mit 0,5 & mgr; M RA.
4. Platte 100 von 20 & mgr; l-Tropfen pro 100-mm-Petrischale mit einer 8-Kanal-Pipette und 200 & mgr; L Spitzen, InvertzuckersirupDie Schalen und den invertierten Deckel mit PBS füllen hängende Tropfen vor dem Austrocknen zu verhindern. Schützen RA haltigen Kulturmedien von Licht.
5. Kultur EBs in hängenden Tropfen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 4 Tage.

5. 2D EB Kultur

1. Mantel 12 mm runde Glasdeckgläser mit 30 ug / ml Fibronektin für 30 min bei RT. Platzieren jedes Deckglas in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte und 1 mL IMDM pro Vertiefung.
2. Ernte 3 Tage gewachsenen Tropfen hängen ein EBs durch eine mit 200 ul Pipettenspitzen und Samen sie auf den Fibronektin-beschichtete Deckgläser, 20 EBs pro Vertiefung, die gleichen Pipettenspitzen.
   HINWEIS: 3-Tage-EBs bevorzugt über 4-Tage-EBs, weil sie auf die Deckgläser besser haften.
3. Weiter Kultur mit IMDM-15% FBS ohne LIF. Ersetzen Sie das Medium alle 3-4 Tage. Sammeln Sie das verwendete Medium zur Analyse Proteinsekretion nach Bedarf.

6. Nachweis von sekretierten Proteinen

1. Übertragen Sie 500 ul von EB medimgr; m bis 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter, Schleudern bei 20.000 xg für 60 min bei 4 ° C.
2. Untersuchen Sie das Medium in den zentrifugalen Filter verbleibenden alle 15-20 min übermäßige Anreicherung zu verhindern. Stoppen Zentrifugation, wenn das Volumen des restlichen Mediums auf 25 & mgr; l abgesunken ist.
3. Sammeln Sie die verbleibenden konzentrierten Medium nach dem Filter Invertieren und bei 160 × g bei 4 ° C dreht, nach den Anweisungen des Herstellers.
4. Erkennt die sekretierten Proteine , die durch ¹⁷ mit spezifischen Antikörpern Immunoblotting.

7. 3D EB Kultur

1. Sammelt die EBs für 4 Tage gezüchtet in hängenden Tropfen, wie in Schritt 5.2 beschrieben ist, und sie in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen (30 EBs pro Röhrchen).
2. Bereiten Sie Kollagen - Gel - Lösung nach den Anweisungen der 3D - Kollagen Kultur - Kit (siehe Materialien / Ausrüstung Tabelle). Verdünnte geeignete Volumina von Kollagenlösung und 5x DMEM (Kit-Komponente); fügen Sie die neutralization Lösung (ein Kit-Komponente) und auch sofort mischen, und halten Sie diese auf dem Eis.
3. Pipettieren ein geeignetes Volumen an gekühlter Kollagenlösung in die 1,5 ml-Röhrchen, die EBs enthalten, und überträgt sanft in den Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen einer 1 ml-Pipettenspitze verwendet wird. Vermeiden Sie Blasen.
4. Sofort übertragen , die Platte auf 37 ° C, 5% CO _2, für 60 min an Kollagen Polymerisation zu initiieren.
5. Overlay die EB-enthaltenden Platte mit IMDM.
6. Ändern Sie das Medium alle 3-4 Tage.

8. EB Dissociation

1. Sammle den Tag 4 EBs (aus Schritt 4) einer nach dem anderen, mit 200 & mgr; l-Pipettenspitzen und sie auf einem nicht haftenden bakteriologische Petrischale mit IMDM mit 15% FBS; Kultur bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 4 Tage. Überprüfen Sie die EBs zweimal täglich, um sicherzustellen, dass sie nicht auf den Boden befestigen; sachte schütteln die Schale EB Befestigung am Boden zu verhindern.
2. Zentrifugieren Sie die EBs bei 185 × g für 5 min beiRT in einer Tischzentrifuge.
3. Entfernen Sie die Überstände. Das Pellet sollte nicht mehr als 100 & mgr; l in jedem Röhrchen.
4. Hinzufügen EBs 1 ml 0,25% Typ pelletisiert I pro Röhrchen Kollagenase, ergänzt mit 20% FBS in PBS.
5. Inkubiere den EB-Kollagenase Gemisch 1 h bei 37 ° C, 5% CO _2, Pipettieren es alle 20 min unter Verwendung von 1 ml - Pipettenspitzen sanft.
6. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit PBS. Wenn Zellaggregate vorhanden sind, verwendet einen Zellsieb mit einem 100-um-Sieb, sie zu entfernen.
7. Ausstrich die Zellen auf einer Gelatine-beschichtete 60-mm-Schalen in IMDM. Dann Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO _2.

9. Transfektion von Dissociated EBs

1. Für qRT-PCR und Immunoblotting fällt eine 6-Well-Platte mit 0,5% Gelatine.
2. Für Immunofluoreszenz mantel Deckgläser mit 30 ug / ml Fibronektin für 30 min bei RT. Legen Sie jedes Deckglas in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. In IMDM.
3. Seed 4,75 x 10 ⁵ oder 1 x 10 & ^sup5 ; dissoziiert EB-Zellen (Schritte von 8,4 bis 8,7) pro Napf in 6-oder 24-Well-Platten sind.
4. Wachsen die Zellen auf 70% Konfluenz vor der Transfektion.
5. Transfizieren der Zellen mit einem nicht - liposomalen Lipid - Stammzell-optimal Reagenz ¹⁷ (siehe Materialien / Ausrüstung Table), die Anweisungen des Herstellers folgend.
   HINWEIS: Die Reagenz wir verwenden typischerweise eine Transfektionseffizienz von 50% erreicht (siehe Repräsentative Ergebnisse).
6. Analyse der Proben durch qRT-PCR oder von ¹⁷ 2 oder 3 Tage nach der Transfektion Immunoblotting, respectively.

10. Analyse von EB Differenzierung durch Immunofluoreszenz

1. Wash 2D EBs oder distanzierter 3D EBs mit PBS und fixiert mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei RT. Waschen Sie die fixierten Zellen mit PBS 3x entfernen Zelldebris schwimmt.
   HINWEIS: Paraformaldehyd ist eine Haut und Augen reizend; Seien Sie vorsichtig beim Umgang.
2. 1% Triton X-100 in PBS, die Zellen für 20 Minuten bei RT durchdringbar zu machen, dann waschen 3x mit PBS.
3. Entfernen PBS und Blockieren mit 5% BSA in PBS für 30 min.
4. Bereiten primäre Antikörperverdünnung in 1% BSA / PBS, ergänzt mit 0,03% Triton X-100. Ersetzen der Blockierungslösung durch die primäre Antikörperlösung. Inkubieren für 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C, dann waschen die Zellen mit PBS 3x.
5. Bewerben sekundären Antikörper in PBS nach den Anweisungen des Herstellers. Inkubation für 1 h bei RT, dann waschen Sie die Zellen mit PBS 3x.
6. Berg Deckgläser auf Objektträgern aus Glas mit einem Anti-faden Medium für die optische Mikroskopie.

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Ergebnisse

Oct4, Nanog und SOX2 sind die Kerntranskriptionsfaktoren, die ESC Selbsterneuerung und Pluripotenz verleihen. Wir wandten das obige Protokoll , um die neuronale Differenzierung von WSR vom Wildtyp und aus einem Stamm von genetisch veränderten Mäusen , wo Syx, ein Gen , kodierend für das RhoA spezifische exchange factor Syx, gestört zu vergleichen. Wir hatten Syx in ¹⁸ Angiogenese beteiligt. Wir bemerkten Unterschiede im Verhalten von EBs von Syx

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Diskussion

In diesem Protokoll stellen wir eine relativ einfache und zugängliche Methode neuronale Differenzierung von murinen WSR zu studieren. In vorangegangenen Protokollen wurde RA auf das Medium am Tag 2 oder Tag hinzugefügt 4 des EB hängenden Tropfen ⁸ oder durch Suspensionskultur bzw. ^7, oder unmittelbar nach der Tropfenaggregation EB ²¹ hängt. In dem Protokoll wir erdacht wurde RA früher gegeben. Trotz der früheren Einführung von RA zu EBs durch...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging