İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Özet

İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.

Özet

Blastosist (genellikle üçüncü gün E3.5 de) iç kütleden izole fare embriyonik kök hücreleri (ESCs), erken dönemde embriyo gelişimini incelemek için in vitro model sistemi olarak da kullanılabilir. lösemi inhibe edici faktör (LİF) yokluğunda, EKH nöral öncü hücrelerine varsayılan göre farklılık göstermektedir. Onlar yüzünden erken evre embriyo olan benzerliği küresel agrega Embriyoit gövdeyi (EB) adı verilen üç boyutlu (3D) içine topladığı edilebilir. EBS iki boyutlu (2D) uzantıları büyüterek genişletmek nerede, fibronektin kaplı lamelleri numaralı seribaşı, ya da küremsiler olarak büyümeye devam ve üç germ içine ayırt 3D kollajen matrislerinde implante edilebilir: endodermal, mezodermal ve ektodermal. 3D kollajen kültür 2D EBS daha yakından in vivo ortamda taklit eder. 2B EB kültür immunfloresan ve farklılaşmayı izlemek için imünolekelemeyle analizini kolaylaştırır. Biz iki adımlı nöral differentia geliştirdiksiyon protokolü. Birinci aşamada, EBS aynı zamanda, retinoik asit (RA) maruz bırakılarak ayırt etmek için uyarılan, asılı bırakma tekniği ile üretilen ve edilmektedir. İkinci aşamada, RA yokluğunda bir 2D veya 3D biçiminde sinir farklılaşma ilerler.

Giriş

EKH blastosist iç hücre kitlesi kaynaklanır. Menşe organizmanın herhangi bir hücre türü ayırt etme kapasitesine sahip, yani bu hücreler, embriyonik dokuda bulunurlar. ESC in vitro farklılaşma geliştirme yolunu ve mekanizmaları araştırmak için bir sistemde kadar geniş ilgi konusudur. Bu hücre ve doku disfonksiyonu düzeltmek için, yeni tedavi yaklaşımları test etmek için bir kuvvetli ve esnek bir model sistem sunmaktadır. EBS erken embriyogenez sırasında hücre farklılaşması birçok yönünü yeniden gündeme getirirler. Embriyo ölümüne yolaçtığı zor embriyonik kusurlar ^{1, 2,} hücresel bir temel belirlemek için yapar Özellikle, EBS kullanılabilir. EBS asılı bırakma veya bir sıvı süspansiyon teknikleri ³ yoluyla oluşturulabilir. Eski avantajı böylece deneysel tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak tutarlı boyut ve yoğunluğu EBS üretme yeteneğidir.

hücre dışı matris (ECM) yapışma proteinleri ile etkileşim yapışan hücre motilitesi ve hayatta kalmayı etkiliyor olabilir. 2B kültür sisteminde, fibronektin genellikle substrata hücre yapışmasını arttırmak için uygulanır. Fibronektin heterodimerleri ⁴ integrin hücre yüzeyine 10 türleri tarafından tanınan bir bazal lamina bileşenidir.

RA sinir farklılaşmasını ^{5, 6} indükler A vitamini küçük lipofilik metabolitidir. RA yüksek konsantrasyonlarda sinir gen ekspresyonunu teşvik etmek ve EB formasyonu ^{7, 8} boyunca mezodermal geni ifade etmek. RA retinaldehit dehidrojenaz ⁹ tarafından nihai ürüne retinaldehit oksidasyon takip eder ya da alkol ya da retinol dehidrojenazı ile, retinaldehit için bir oksidasyon vitamini ile üretilir. Sinir farklılaşma sitoplazmadan RA taşınmasını gerektirir Hücresel RA-bağlayıcı protein 2 (CRABP2) ile çekirdeğe. Çekirdekte RA, RAR-RXR heterodimerin ¹⁰ oluşan bunun kognat reseptörü kompleksine bağlanmaktadır. Bu transkripsiyonel eş-aktivatörleri alımı ve transkripsiyon ^{9, 11} başlatılması ile sonuçlanır. Ayrıca, RA ve böylece BMP ve Smad ¹² sinyal antagonize fosforile (aktif) SMAD1 bozunmasını geliştirmesidir. Bu faaliyetlerin yanı sıra, RA Pax6 ifadesini nöral farklılaşma ¹³ destekleyen bir transkripsiyon faktörü artar. RA sinyal sirtuin-1 (SIRT1), nükleer nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +) 'modüle edilir - çekirdeğe translokasyonu ile müdahale, CRABP2 deacetylates bağlı bir enzim ve bu nedenle RA, RAR-RXR heterodimerin ^{14, 15} bağlanma ^{ile, 16.}

e_content "> Burada anlatılan RA-tedavi EB protokolünü tasarlarken amacımız nöronal öncü hücrelerine ESC farklılaşmasını regüle sinyal yollarının in vitro analizini kolaylaştırmak amacıyla nöral farklılaşma optimize etmektir. Bu protokolün avantajlarından biri kolaylaştırılmasıdır immünfloresans. 3D EBS tarafından hücre fonksiyonunun analizi de antikorlar tarafından nüfuz ve nöral farklılaşma odaklı mikroskopi ile immunolabeling ve hücrelerin görüntüleme kolaylaştırır sırasında belirli zaman noktalarında 2D tek tabaka halinde görüntü. EB ayrışma zordur değildir.

Protokol

Fare embriyonik fibroblastlar 1. Kültür (MEF'ler)

1. MEF orta hazırlayın,% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM yüksek glukoz).
2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (RT),% 0.5 jelatin çözeltisi ile kaplayın 100 mm'lik bir hücre kültür tabakları.
3. Bir Sitometreyi kullanılarak MEFS sayın. jelatin çözeltisi çıkarın ve hemen MEF ortamı 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılmış dökün. Hızla, daha sonra 2 dakika süre ile 37 ° C bir su banyosu içinde mitomisin C ile muamele edilmiş MEF'lerin şişeler çözülme 100 mm jelatin kaplı kap başına 2.8 x 10 ⁶ MEFS tohum. Diğer boyutlardaki getirme tabağı kullanılarak Buna göre hücre sayısını ayarlar. Gece boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 de MEFS inkübe edin.
4. ertesi gün orta değiştirin. MEF katmana kadar 2-3 gün Kültür birleşik olduğunu.

2. Fare ESC Kültürü

1. ESC orta hazırlayın, Iscove'un değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) içinde% 15 FBS ve 10 ile takviye3 U / ml, lösemi önleyici faktörü (LİF), 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 55 mM 2-merkaptoetanol, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), gentamisin (200 ug / mL), ve% 0.2 mycoplasma antibiyotik.
2. aşama 1 'de hazırlanan çanak MEF Ortamı çıkarın ve 37 ° C'lik önceden ısıtılmış ESC orta ile değiştirin.
3. MEF tabakanın üstüne ESC şişe ve tohum hücreleri Defrost. EKH kaynaşmaya erişene kadar, 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe edin.
4. MEF'lerin konfluent tek tabaka içeren yeni hücre kültürü yemekleri hazırlayın. Geçit için EKH, bir kez PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de,% 5 _CO2 2-5 dakika süreyle /% 0.25 tripsin ile EDTA ayırmak. , Ayırma hücrelere% 15 FBS ile taze IMDM ekleyerek tripsinizasyon durdurma oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 160 x g'de hücre, bir 15 ml tüp süspansiyon ve santrifüj aktarın.
5. Süpernatant, taze IMDM ve geçit her yeni, MEF-kaplı çanak hücrelerin beşte biri ile tekrar süspansiyon EKH çıkarın; hücreler kadar kuluçkayaizdiham (tipik olarak 4-5 gün) ulaşır.

3. Jelatin kaplı levhalarda MEFS ve Kültür EKH çekin

1. ECSS bir araya gelerek konfluens kez, taze IMDM hücrelerin tekrar süspansiyon, adım 2.4 gibi% 0.25 tripsin / EDTA ile ve MEFS ayırmak yapışkan olmayan bir bakteriyolojik petri tabağına transfer edin ve 37 ° C'de,% 5 COz, 40 dakika süre ile inkübe _2.
2. Dikkatle tekrar pipetleme kaçınarak ESCs ve 5 ml pipet kullanarak yeni bir jelatin-kaplı plakaya orta MEF'ler içeren aktarın. EKH uymayan beri petri kaplarında kalan hücreler, MEF bulunmaktadır.
3. Passage EKH her 3-4 günde. Daha az sıklıkla pasajı ESC pluripotensini azaltabilir. o farklılaşmayı lehine olabileceğinden% 60 izdiham aşmayın.
4. MEF emin MEF mevcut değilse yapmak, bir 20X objektif kullanarak, bir hücre kültürü mikroskobu ile artık tespit olana kadar tekrarlayın, gerektiği gibi, 3.2-3.3 üç kez ya da daha fazla adımlar.
5. ESC kontrol ederek ESC pluripotensini doğrulamaHücreler tipik ESC çokgen morfoloji (Şekil 1A) ile yoğun koloniler oluşturur eğer kültür görmek için. Ters transkriptaz polimeraz zincir ¹⁷ immunoblotting reaksiyonu (qRT-PCR), ^17, ya da çekirdek pluripotense transkripsiyon immünofloresansla test hücre stemness ¹⁷ (Şekil 2) faktörleri.

4. EB oluşumu

1. 1.5 ml hafif korunan mikrofüj tüplerine, all-trans-RA stok DMSO içinde 10 mM'de solüsyonu ve kısım hazırlayın. Çözelti, iki haftaya kadar -80 ° C 'de stabildir. Işıktan koruyun.
2. adım 2.4 gibi tripsinize ESCs; tek bir hücre süspansiyonu olarak, LİF olmadan taze IMDM replate.
3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 0.5 uM RA IMDM 5 x 10 ⁵ hücre / ml süspansiyon hazırlamak.
4. Levha 100, 8 kanallı pipet ile 100 mm petri kabı başına 20 uL-damla ve 200 uL uçları, tersyemekleri ve kurutma asılı damla önlemek için PBS ile ters kapak doldurun. Işıktan RA içeren kültür ortamı koruyun.
5. Asılı Kültür EBS 4 gün, 37 ° C,% 5 _CO2 de düşer.

5. 2B EB Kültürü

1. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30 ug / ml fibronektin ile kaplayın, 12 mm yuvarlak cam lameller. 24 kuyucuklu bir plakanın bir oyuk her lamel yerleştirin ve her bir kuyucuk için 1 ml IMDM ekleyin.
2. Hasat 3 gün yetiştirilen 200 mcL pipet uçlarıyla birer damla EBS birini asılı ve aynı pipet uçları kullanılarak, kuyu başına, fibronektin kaplı lamelleri 20 EBS onları tohum.
   NOT: lamelleri daha iyi yapışır, çünkü 3 günlük EBS 4 günlük EBS üzerinde tercih edilir.
3. LIF olmadan IMDM-% 15 FBS ile kültürü devam edin. Her 3-4 gün orta değiştirin. Gerektiğinde, protein salgılanması analizi için kullanılan ortam toplayın.

Salgılanan Proteinlerin 6. Algılama

1. EB medi 500 mcL aktarınum için 10 kDa'ya kesme santrifüj filtreler, 4 ° C'de 60 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj.
2. merkezkaç filtrelerin içindeki aşırı zenginleşmesini önlemek için her 15-20 dakika kalan orta inceleyin. Kalan ortamının hacmi 25 uL düştüğü zaman santrifüj durdurun.
3. filtre tersine çevrilmesi ve 4 ° C'de 160 x g'de iplik, üretici talimatlarına göre sonra kalan konsantre edilir ortamı toplayın.
4. Spesifik antikorların ¹⁷ ile immün salgılanan proteinleri algılar.

7. 3D EB Kültürü

1. Adım 5.2'de tarif edildiği gibi damla asılı 4 gün için büyütülmüştür EBS toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüp (tüp başına 30 EBS) koyun.
2. 3D kolajen kültür kit talimatlarına (/ Ekipman Tablo Malzeme) takip eden kolajen jel çözeltisi hazırlayın. kolajen çözeltisi ve 5x DMEM (bir kit bileşeni) uygun hacimleri seyreltin; n eklemekeutralization çözeltisi (bir kit bileşeni) ve iyi derhal karıştırın ve buz üzerinde kalsın.
3. EBS içeren 1.5 ml tüp içine soğutulmuş kolajen çözeltisinin uygun bir hacmi Pipet ve yavaşça 1 ml bir pipet kullanarak, 6 gözlü bir plakanın kuyularına aktarın. kabarcıkları yapmaktan kaçının.
4. Hemen kolajen polimerizasyonu başlatmak için 60 dakika boyunca, 37 ° C'de,% 5 _CO2 plaka transfer.
5. IMDM EB içeren plaka kaplaması.
6. Her 3-4 gün orta değiştirin.

8. EB Ayrışma

1. 200 uL pipet uçlarıyla, tek tek (aşama 4'den), günde 4 EBS toplamak ve% 15 FBS ile yapışkan olmayan bakteriyel petri tabağı içeren IMDM aktarmak; 37 ° C, 4 gün daha% 5 _CO2 kültür. dibe takmak olmadığından emin olmak için EBS iki kez her gün kontrol edin; nazikçe altına EB eki önlemek için yemek sallayın.
2. 5 dk için 185 x g'de santrifüj EBSRT, bir tezgah üstü santrifüj içinde.
3. süpernatantlar çıkarın. Topak, her bir tüp içinde 100 uL aşmamalıdır.
4. PBS içinde% 20 FBS ile takviye edilmiş bir tüp başına kolajenaz EBS 1 ml% 0.25 türü, topak haline ekle.
5. 37 ° C'de,% 5 _CO2 de 1 saat için EB-kollajen karışımı inkübe 1 ml pipet uçları kullanılarak, yavaşça 20 dakikada bir pipetleme.
6. PBS ile hafifçe 3x hücreleri yıkayın. hücre agregatları, mevcut olduğu takdirde, bunları çıkarmak için bir 100 um elek içeren bir hücre filtresi kullanılır.
7. IMDM bir jelatin kaplı 60 mm'lik tabaklar üzerinde hücreleri Replate. Daha sonra, 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edin.

Ayrılan EBS 9. transfeksiyonu

1. qRT-PCR ve immüno kat% 0.5 jelatin ile bir 6-yuvalı plaka için.
2. immünofloresan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30 ug / ml fibronektin ile kat cam kapak slipleri için. 24 kuyucuklu bir plakanın bir oyuk her lamel yerleştirin. IMDM ekleyin.
3. Tohum 4.75 x 10 ⁵ veya 1 x 10 ⁵ ayrışmış EB hücreleri (8.4-8.7 adımlar) kuyuda 6- veya 24 oyuklu plakalar başına.
4. Transfeksiyondan önce% 70 konflüansa hücreleri büyütün.
5. Üreticinin talimatlarını izleyerek (/ Ekipman Tablo Malzeme) bir lipozomal olmayan lipit kök hücre-optimum reaktif ¹⁷ tarafından hücrelere nükleik asit.
   NOT: Kullanılan reaktif,% 50'lik bir transfeksiyon etkinliği ulaştı (Örnek Sonuçlar bakınız).
6. QRT-PCR ile ya da sırasıyla ¹⁷ 2 veya 3 gün sonra transfeksiyon immünoblotlama ile örnekleri analiz.

Immünofloresansla EB Farklılaşma 10. Analizi

1. Yıkama 2D EBS veya PBS ile ayrıştırılmış 3D EBS ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile yapışması. Sabit hücreler, hücre enkaz yüzen kaldırmak için PBS ile 3 kez yıkanır.
   NOT: Paraformaldehyde bir cilt ve göz tahriş edicidir; bunu tutarken dikkatli olun.
2. daha sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hücreler geçirgen PBS ile 3 kez yıkama için PBS içinde% 1 Triton X-100 ilave edin.
3. PBS çıkarın ve 30 dakika boyunca PBS içerisinde% 5 BSA ile bloke eder.
4. % 1 BSA içinde birincil antikor seyreltme hazırlayın / PBS% 0.03 triton-X-100 ile desteklenmiştir. Primer antikor solüsyonu ile bloke çözeltisi değiştirin. Oda sıcaklığında 3 saat süre ile inkübe veya gece boyunca 4 ° C 'de, daha sonra hücreler, PBS ile 3 kez yıkanır.
5. üreticinin talimatlarına göre PBS ikincil antikor uygulayın. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, daha sonra hücreler, PBS ile 3 kez yıkayın.
6. Dağı optik mikroskopi için bir anti-solma ortamı ile cam slaytlar lamelleri.

Sonuçlar

Oct4, Nanog ve Sox2 ESC kendini yenileme ve pluripotensini veren çekirdek transkripsiyon faktörleridir. Vahşi tip ve Syx, RhoA spesifik değişim faktörü Syx kodlayan bir gen, bozulur genetik olarak modifiye edilmiş bir fare suşundan elde ESC'lennin nöral farklılaşmasını karşılaştırma yukarıdaki protokol uygulanmıştır. Biz anjiyogenez ^18'de syx karıştığı almıştı. ^{/ - -} EKH ve syx nöral fark...

Tartışmalar

Bu protokolde, kemirgen ESC'lennin nöral farklılaşma çalışma için nispeten basit ve erişilebilir bir yöntem sunulmaktadır. Daha önceki protokollarda, RA günde 2 veya EB asılı ^{damla, 8} gün 4 veya süspansiyon kültürü ⁷ tarafından ortam ilave edildi, EB damla agregasyonu ²¹ asılı, sırasıyla, ya da hemen sonra. Biz icat Protokolde, RA daha önce eklenmiştir. Süspansiyon kültürü ile oluşturulmuş EBS için RA'nın da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging