두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

요약

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

초록

배반포 (일반적으로 일 E3.5에서)의 내부 물질로부터 격리 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 초기 배아 발달을 연구하기위한 체외 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다. 백혈병 억제 인자 (LIF)가 없을는 ESC를 신경 전구 세포로 분화 기본적. 이들은 인해 초기 단계 배아의 유사성 구형 집합체 배아 체 (EB)을 지칭 삼차원 (3D)에 축적 될 수있다. 교환 사채는 두 가지 차원 (2D) 확장을 성장으로 확장 곳, 피브로넥틴 코팅 커버 슬립에 시드, 또는 그들이 회전 타원체로 성장을 계속하고 3 개 개의 배엽으로 분화 3D 콜라겐 매트릭스에 이식 할 수 있습니다 내배엽, 중배엽과 외배엽. 3 차원 콜라겐 문화는 2D 사채보다 더 밀접하게 생체 내 환경을 모방. 2 차원 EB 문화는 면역과 차별화를 추적하기 위해 면역 블에 의해 분석을 용이하게합니다. 우리는 두 단계 신경 differentia을 개발했다기 프로토콜입니다. 첫 번째 단계에서, 사채 동시에, 레티노 산 (RA)에 대한 노출에 의해 분화 유도되고, 상기 걸이 드롭 방법에 의해 발생하고있다. 두 번째 단계에서, RA의 부재 2D 또는 3D 포맷에서 신경 분화를 진행한다.

서문

는 ESC는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래. 그들이 기원의 유기체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력을 가지고 즉,이 세포는 만능이다. ESC 체외 분화 발달 경로와 메커니즘을 조사하는 실험적인 시스템으로 폭 넓은 관심이다. 그것은 세포와 조직 기능 장애의 교정을위한 새로운 치료 방법을 테스트 할 수있는 강력하고 유연한 모델 시스템을 제공합니다. 교환 사채는 초기 배 발생 동안 세포 분화의 여러 측면을 요점을 되풀이. 배아 치사가 어려운 배아 결함 ^{(1, 2)의} 셀룰러 기반을 결정하게 될 때 특히 EB를 사용할 수있다. 사채가 매달려 드롭 또는 액체 현탁액 기술 ⁽³⁾ 중 어느 하나를 형성 할 수있다. 전자의 이점은, 따라서 실험 재현성을 용이 일관된 크기 및 밀도 사채를 생성하는 능력이다.

세포 외 기질 (ECM) 접착 단백질과의 상호 작용이 부착 세포의 운동성 및 생존에 영향을 미칠 수있다. 2 차원 배양 시스템에있어서, 피브로넥틴은 종종 기판과 세포 접착을 증가인가된다. 피브로넥틴은 이종 ^{4 인테그린} 세포 표면의 10 개 종류로 인식 기저판 성분이다.

RA는 신경 분화 ^{(5, 6)을} 유도하는 비타민 A의 작은 친 유성 대사 산물이다. RA 고농도 신경 유전자 발현을 촉진하고 EB 형성 ^{7, 8} 중 중배엽 유전자 발현을 억제한다. RA는 레티 날 탈수소 효소 ^(9)에 의해 최종 제품 레티 산화 다음 중 알코올 탈수소 효소, 레티놀, 레티 날에 의해 산화 비타민 의해 제조된다. 신경 분화는 세포질에서 RA의 전송을 필요로 셀룰러 RA 결합 단백질 2 (CRABP2)에 의한 핵. 핵에서, RA는 RAR-RXR 헤테로 ¹⁰ 이루어진 동종 수용체 복합체에 결합한다. 이 전사 공동 활성제의 모집 및 전사 ^{(9), (11)의} 시작을 초래한다. 또한, RA 따라서 BMP 및 SMAD ¹² 시그널링 길항 인산화 (활성) SMAD1의 분해를 촉진시킨다. 이러한 활동 외에, RA는 PAX6 식 신경 분화 ^{13을지지하는} 전사 인자를 증가시킨다. RA 시그널링 시르-1 (SIRT1) 핵 니코틴 아마이드 아데닌 다이 뉴클레오타이드 (NAD +)에 의해 변조되고, - 핵으로의 전좌 방해 CRABP2을 deacetylates 의존성 효소, 따라서 RA가 RAR-RXR 헤테로 ^{14 (15)에 결합하여, (16).}

e_content은 "> 여기에 설명 된 RA 처리 EB 프로토콜을 설계하는 우리의 목표는 신경 전구 세포에 ESC 분화를 조절하는 신호 전달 경로의 체외 분석을 용이하게하기 위해 신경 분화를 최적화하는 것입니다.이 프로토콜의 장점 중 하나의 촉진이다 면역. 3D 사채 의한 세포 기능의 분석은 또한 항체 관통 신경 분화를 공 초점 현미경에 의해 immunolabeling 및 세포 이미징을 용이하게하는 동안 특정 시점에서 2 차원 단층으로 이미지. EB 해리하기 어려운 것은 아니다.

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프로토콜

마우스 배아 섬유 아 세포의 (1) 문화 (MEFs에)

1. MEF 매체를 준비, 15 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM, 고 글루코스).
2. 실온에서 30 분 (RT) 0.5 % 젤라틴 용액 코트 100mm 세포 배양 접시.
3. 세포 계측기를 사용하여 MEFs에를 계산합니다. 젤라틴 용액을 제거하고 즉시 MEF 매체는 37 ° C로 미리 예열 붓는다. 급속 다음, 2 분 동안 37 ° C의 물 배스에서 마이 토마 이신 C 처리 된 MEFs의 바이알을 해동 100mm 젤라틴 코팅 접시 당 2.8 × ¹⁰⁶ MEFs에 시드. 다른 크기의 접시를 사용하는 경우 그에 따라 세포 수를 조정합니다. 밤새 37 ° C, 5 % CO _2에서 MEFs에 부화.
4. 다음날 매체를 변경합니다. MEF의 계층까지 2-3 일 동안은 문화 합류한다.

2. 마우스 ESC 문화

1. ESC 매체를 준비 Iscove 개변 둘 베코 배지 (IMDM)를 15 % FBS가 보충 된 103 U / ㎖ 백혈병 억제 인자 (LIF), 0.1 mM 비 필수 아미노산, 55 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), 겐타 마이신 (200 ㎍ / ㎖), 0.2 % 마이코 플라즈마 항생제.
2. 단계 1에서 제조 한 접시 MEF에서 배지를 제거하고 37 ° C 예열 ESC 배지로 교체한다.
3. MEF의 층의 상부에 ESC 바이알 종자 세포 제상. 는 ESC가 합류에 도달 할 때까지 37 ° C, 5 % CO _2에서 인큐베이션.
4. MEFs에의 합류 단일 층을 포함하는 새로운 세포 배양 접시를 준비합니다. 통과하기는 ESC는 PBS로 한번 세척하고, 37 ℃, 5 % CO _2에서 2-5 분 / 0.25 % 트립신 EDTA로 분리. 상기 세포 분리에 15 % FBS와 신선한 IMDM을 첨가함으로써 트립신을 중지 RT에서 5 분 동안 160 XG에서 세포 15 ㎖의 튜브에 현탁하고, 원심 분리기를 옮긴다.
5. 상등액 신선한 IMDM 통로 및 각각의 새로운 MEF 코팅 접시에 세포를 1/5로 재현 탁의 제거는 ESC; 세포까지 품다합류 (일반적으로 4~5일)에 도달.

3. 젤라틴 코팅 플레이트에 MEFs에와 문화는 ESC를 철회

1. 이개 상피가 합류에 도달하면, 새로운 IMDM에서 세포를 재현 탁 단계 2.4에서 0.25 % 트립신 / EDTA로하고 MEFs에 분리 비 접착 세균 배양 접시로 전송하고, 37 ° C, 5 % CO에서 40 분 동안 배양 _2.
2. 조심스럽게 피펫 반복을 피하기는 ESC 및 5 ㎖ 피펫을 사용하여 새로운 젤라틴 - 코팅 된 플레이트에 배지를 함유 MEFs에 옮긴다. 는 ESC가 준수하지 않기 때문에 배양 접시에 남아있는 세포는, MEFs에 있습니다.
3. 통로는 ESC 3-4 일마다. 덜 자주 계대는 ESC의 다 능성을 줄일 수 있습니다. 이 차별화를 선호 할 수있다로, 60 %의 합류를 초과하지 마십시오.
4. MEFs에 확실 MEFs에이 존재하지 않는 수 있도록, 20 배 목표를 사용하여, 세포 배양 현미경으로 더 이상 감지 될 때까지 반복하여, 필요에 따라 3.2-3.3 3 회 이상 단계를 반복합니다.
5. ESC를 확인하여 ESC의 분화능을 확인세포가 전형적인 ESC 다각형 형태 (그림 1A)와 밀도 식민지를 형성하는 경우의 문화를 확인합니다. 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 ^(17)을 면역 블 (QRT-PCR) ⁽¹⁷⁾ 또는 코어 능성 전사 면역하여 테스트 셀 stemness ¹⁷ (도 2) 인자.

4. EB 형성

1. 1.5ml의 광 보호 된 미세 원심 분리 튜브에 올 - 트랜스 RA-DMSO 스톡 10mm의 용액으로하고, 분취 액을 준비한다. 이 솔루션은 최대 2 주 동안 -80 ° C에서 안정적이다. 빛으로부터 보호.
2. 단계 2.4에서와 같이를 Trypsinize는 ESC; 단일 세포 현탁액으로, LIF없이 신선한 IMDM에 replate.
3. 혈구를 이용하여 세포 수 및 0.5 μM의 RA와 IMDM에서 5 × ¹⁰⁵ 세포 / ㎖ 현탁액을 준비한다.
4. 플레이트 (100)는 8 채널 피펫으로 100 mm 페트리 접시 당 20 μL 방울 200 μL 팁, 반전요리 및 건조에 매달려 방울을 방지하기 위해 PBS와 반전 뚜껑을 입력합니다. 빛 RA 함유 배지를 보호한다.
5. 매달려 문화 사채 4 일 동안, 37 ° C, 5 % CO _2에서 떨어진다.

5. 2D EB 문화

1. RT에서 30 분 동안 30 ㎍ / mL의 피브로넥틴 코트 12mm 원형 유리 커버 슬립. 24- 웰 플레이트의 각 웰에 커버 슬립을 배치하고, 웰 당 1 ㎖의 추가의 IMDM.
2. 수확 삼일 성장한 200 μL 피펫 팁 하나 드롭 사채 하나 걸려와 같은 피펫 팁을 사용하여, 잘 당 피브로넥틴 코팅 커버 슬립에 20 EBS을 (를)을 씨앗.
   주 :이 커버 슬립에 더 나은 준수하기 때문에 3 일 교환 사채는 4 일 사채를 통해 바람직하다.
3. LIF없이 IMDM-15 % FBS와 문화를 계속합니다. 3-4 일마다 중간 교체합니다. 필요한 단백질 분비 분석을 위해 사용 된 배지를 수집한다.

분비 단백질 6. 검출

1. EB의 메디 500 μL로 이동UM-10 kDa의 원심 컷오프 필터, 4 ° C에서 60 분 동안 20,000 XG 스핀.
2. 원심 필터 내부 과도한 농축을 방지하기 위해 모든 15-20 분 잔여 매체를 조사한다. 나머지 매체의 볼륨은 25 μL로 떨어진 경우 원심 분리를 중지합니다.
3. 필터를 반전 및 39 ° C에서 160 XG에서 회전, 제조자의 지침에 따라 후 남은 농축 매체를 수집한다.
4. 특이 항체로 면역 블 ^(17)에 의해 분비되는 단백질을 검출한다.

7. 3D EB 문화

1. 단계 5.2에 기재된 바와 같이 드랍 걸려 4 일 동안 성장시킨 EB를 수집하고, 1.5 mL의 원심 분리 튜브 (튜브 당 30 사채)에 배치.
2. 3 차원 콜라겐 문화 키트의 지시 (/ 장비 표 자료 참조) 다음과 같은 콜라겐 겔 용액을 준비합니다. 콜라겐 용액 배 DMEM (키트 성분)의 적절한 부피를 희석; n 개의 추가eutralization 솔루션 (키트의 구성 요소) 잘 즉시 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
3. EB를 함유 1.5 ㎖의 튜브에 냉장 콜라겐 용액의 적절한 용적을 피펫 부드럽게 1 mL를 피펫 팁을 사용하여 6 웰 플레이트의 웰에 옮긴다. 거품을 피합니다.
4. 즉시 콜라겐 중합을 개시 60 분, 37 ° C, 5 % CO ₂ 플레이트를 옮긴다.
5. IMDM와 EB 함유 플레이트 오버레이.
6. 3-4 일마다 중간 변경합니다.

제 EB 해리

1. 200 μL 피펫 팁 하나씩 (4 단계)를 4 일 EB를 수집하고 15 % FBS와 비 - 접착 성 세균 배양 접시에 함유 IMDM로 전송; 37 ° C, 4 일 이상, 5 % CO _2에서 배양. 그들은 바닥에 부착하지 않도록 만들기 위해 사채을 두 번 매일 확인; 부드럽게 아래로 EB 부착을 방지하기 위해 접시를 흔들.
2. 5 분에서 185 XG에서 사채를 원심RT, 벤치 탑 원심 분리기한다.
3. 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 각 튜브에 100 μL를 초과하지 않아야한다.
4. PBS에 20 % FBS가 보충 된 I 튜브 당 1 ㎖의 콜라게나 사채 0.25 % 유형, 펠릿에 추가.
5. 37 ° C, 5 % CO _2에서 1 시간위한 EB-콜라게나 인큐베이션 혼합물을 1 mL의 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 매 20 분을 피펫.
6. PBS로 부드럽게 배 세포를 씻으십시오. 세포 집합체가있는 경우,이를 제거하기 위해 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 사용합니다.
7. IMDM에 젤라틴 코팅 60mm 요리에 세포를 Replate. 이어서 37 ° C, 5 % CO _2에서 배양한다.

해리 사채 항 형질

1. QRT-PCR과 면역 코트 0.5 % 젤라틴과 6 웰 플레이트.
2. 면역, RT에서 30 분 동안 30 ㎍ / mL의 피브로넥틴 코트 커버 글라스를 들어. 24- 웰 플레이트의 각 웰에 커버 슬립을 놓는다. IMDM를 추가합니다.
3. 시드 4.75 × ^105, 1 × ¹⁰⁵ 해리 EB 셀 (8.4-8.7 단계) 6- 웰 또는 24 웰 플레이트 당.
4. 형질 감염 전에 70 % 합류로 세포를 성장한다.
5. 제조업체의 지침에 따라, (/ 장비 표 자료 참조) nonliposomal 지방 줄기 세포 - 최적의 시약 ^(17)에 의해 세포를 형질.
   참고 : 우리는 사용되는 시약은 일반적으로 50 %의 형질 전환 효율에 도달 (대표 결과를 참조).
6. QRT-PCR에 의해 또는 각각 ¹⁷ 2, 3 일 후 형질 발현 수준으로 샘플을 분석한다.

면역 형광에 의해 EB 분화 10. 분석

1. 워시 사채 2D 또는 3D PBS로 해리 사채 및 RT에서 30 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 고정한다. 고정 된 세포가 세포 파편을 떠 제거하는 PBS로 3 배 씻으십시오.
   참고 : 파라 포름 알데히드는 피부와 눈에 자극이다; 그것을 취급시주의하십시오.
2. 그 후, 실온에서 20 분간 세포를 Permeabilize 하시려면 PBS로 3 회 세척 PBS에 1 % 트리톤 X-100을 추가한다.
3. PBS를 제거하고 30 분 동안 PBS 중 5 % BSA로 차단.
4. 1 % BSA에서 희석 차 항체를 준비 / PBS 0.03 % 트리톤 X-100을 보충. 차 항체 용액 차단 솔루션을 교체합니다. RT에서 3 시간 동안 배양 또는 밤새 4 ℃에서, 그 다음 세포를 PBS로 3 배 씻는다.
5. 제조업체의 지침에 따라 PBS에서 이차 항체를 적용합니다. RT에서 1 시간 동안 배양 한 후 세포를 PBS로 3 배 씻는다.
6. 마운트는 광학 현미경을위한 안티 - 페이드 매체와 유리 슬라이드에 커버 슬립.

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결과

Oct4는, Nanog를, 및 SOX2는 ESC 자기 갱신과 다 능성을 부여하는 핵심 전사 인자이다. 우리는 야생형과 SYX 상기에서 RhoA 특정 과거 SYX 인자를 코딩하는 유전자가 파괴되어 유전자 변형 마우스의 균주는 ESC의 신경 분화를 비교하기 위해 상기 프로토콜을 적용 하였다. 우리는 혈관 신생 ¹⁸ SYX을 내포했다. ^{- / -는} ESC를하고 SYX의 신경 ?...

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토론

이 프로토콜에서 우리는 생쥐는 ESC의 신경 분화를 연구하는 비교적 간단한 접근 방법을 제시한다. 이전의 프로토콜에서는, RA가 제 2 일 또는 EB 매달려 드롭 ^(8)의 제 4 일 또는 현탁 배양 물 ^(7)을 배지에 첨가하고, EB 드롭 집합 ^{(21)에 걸려} 각각 또는 직후. 우리가 고안 한 프로토콜에서, RA는 이전 하였다. 현탁 배양에 의해 형성 사채 RA의 초기 도...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging