ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Summary

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

Abstract

תאי גזע עובריים עכבר (ESCs) מבודדים מן המסה הפנימית של הבלסטוציסט (בדרך כלל ב E3.5 יום), יכול לשמש כמערכת מודל במבחנה לחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. בהעדר גורם מעכבות לוקמיה (LIF), ESCs להבדיל כברירת מחדל לתוך תאים עצביים מבשר. הם יכולים להיות צברו לתוך תלת ממדים (3D) המצרפי כדורי כינת גוף embryoid (EB) בשל הדמיון שלה לעובר בשלב מוקדם. EBS ניתן זורעים על coverslips פיברונקטין מצופה, ושם מתפשטים ידי הגוברת שני ממדי (2D) הרחבות, או מושתל מטריצות קולגן 3D שבו הם להמשיך ולצמוח כפי spheroids, להתמיין שכבות נבט שלושה: endodermal, mesodermal, ו ectodermal. תרבות קולגן 3D המחקה את הסביבה vivo הדוק יותר מאשר EBS 2D. תרבות 2D EB מקלה על ניתוחים ידי immunofluorescence ו immunoblotting לעקוב בידול. פתחנו differentia שני שלבים עצבייםפרוטוקול tion. בשלב הראשון, EBS נוצרת על ידי טכניקת תליית הטיפה, וגם, בו זמנית, הם המושרה להבדיל ידי חשיפת חומצה רטינואית (RA). בשלב השני, התמיינות עצבית בפורמט 2D או 3D בהעדר RA.

Introduction

ESCs מקורם מסת התאים הפנימית הבלסטוציסט. תאים אלה הם pluripotent, כלומר יש להם את היכולת להתמיין לכל סוג תא של האורגניזם ממוצא. בידול ESC במבחנה הוא עניין רחב כמערכת ניסיונית חוקר מסלולים ומנגנונים התפתחותי. הוא מציע מערכת מודל חזקה וגמישה לבחון גישות טיפוליות חדשות תיקון של תפקוד תאים ורקמות. EBS לשחזר היבטים רבים של התמיינות תאים במהלך העובר מוקדם. בפרט, EBS ניתן להשתמש כאשר הקטלניות עובריים מקשה לקבוע את הבסיס התאי של מומים עובריים ^{1, 2.} EBS יכול להיוצר גם על ידי Drop Hanging או טכניקות השעיה נוזלות ^3. היתרון של לשעבר הוא היכולת ליצור EBS של גודל וצפיפות עקביים, ובכך להקל על שחזור ניסיוני.

= נער "jove_content"> אינטראקציה עם תאי מטריקס (ECM) חלבונים דבקים עשויה להשפיע על תנועתיות והישרדות של תאים חסידים. במערכת התרבות 2D, פיברונקטין מוחל לעתים קרובות כדי להגדיל את הידבקות התא למצע. פיברונקטין הוא מרכיב lamina בסיס מוכר על ידי 10 סוגים של פני שטח תא integrin heterodimers ^4.

RA הוא מטבוליט lipophilic קטן של ויטמין A אשר גורמת בידול עצבי ^{5, 6.} ריכוזים גבוהים של RA לקדם ביטוי גנים עצבי ואת מדחיקת ביטוי גני mesodermal במהלך היווצרות ^{7 EB, 8.} RA מופק על ידי ויטמין A חמצון כדי retinaldehyde ידי אחד dehydrogenase אלכוהול או רטינול, ואחריו חמצון retinaldehyde למוצר הסופי על ידי retinaldehyde דהידרוגנז ^9. בידול עצבי דורש הובלה של RA מן הציטופלסמה אל הגרעין ידי חלבון תאי RA-מחייב 2 (CRABP2). בגרעין, RA נקשר לקולטן מורכב מאותו המקור שלה מורכב heterodimer RAR-RXR ^10. התוצאה היא גיוס של ממריצים-שיתוף תעתיק, וגם בהוצאת תעתיק ^{9, 11.} יתר על כן, RA מקדמת את ההשפלה של פוספורילציה (פעיל) SMAD1, ובכך קומם BMP ו הסמאד איתות ^12. בנוסף לפעילויות אלה, RA מגביר ביטוי Pax6, גורם שעתוק התומך בידול עצבי ^13. איתות RA היא מווסתת על ידי הסירטואינים-1 (SIRT1) חברה dinucleotide אדנין nicotinamide גרעיני (NAD +) - אנזים תלוי כי הוא מסיר קבוצות אצטיל CRABP2, מפריעים טרנסלוקציה שלו אל גרעין, ולכן עם RA מחייב heterodimer RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> מטרתנו בעיצוב פרוטוקול EB RA שטופל המתואר כאן היא למטב בידול עצבי כדי להקל במבחנת ניתוח של מסלולי איתות המווסתים בידול ESC לתוך תאים מבשרים עצביים. אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא סיוע של הניתוח של תפקוד תא על ידי immunofluorescence. EBS 3D אינו חדר היטב על ידי נוגדנים וקשים תמונה. דיסוציאציה EB לתוך בשכבת 2D בנקודות ספציפיות עת במהלך בידול עצבי מקל immunolabeling הדמיה של התאים על ידי מיקרוסקופ confocal.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תרבות של פיברובלסטים עכבר עובריים (MEFs)

1. כן בינוני MEF, המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM, גבוהה גלוקוז), בתוספת 15% בסרום שור עובר (FBS).
2. מנות תרבית תאים מעיל 100 מ"מ עם פתרון ג'לטין 0.5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. רוזן MEFs באמצעות cytometer. סר פתרון ג'לטין ומייד שופכים בינוניים MEF מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. במהירות להפשיר בקבוקונים של MEFs mitomycin שטופלו צלזיוס באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, אז הזרע 2.8 x 10 ⁶ MEFs לכל 100 מ"מ צלחת ג'לטין מצופה. התאם מספר סלולארי בהתאם אם באמצעות מנות בגדלים אחרים. דגירה MEFs לילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2.
4. שינוי המדיום ביום הבא. תרבות במשך 2-3 ימים עד שכבת MEF היא ומחוברות.

2. עכבר ESC תרבות

1. כן בינוני ESC, המדיום של Dulbecco השונה של Iscove (IMDM) השלים עם 15% FBS ו 103 גורם מעכבות לוקמיה U / mL (LIF), 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 55 מ"מ 2-mercaptoethanol, פניצילין (100 U / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), גנטמיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל), ו 0.2% אנטיביוטיקה mycoplasma.
2. הסר בינוני MEF מצלחת מוכן בשלב 1 ולהחליף עם 37 מעלות צלזיוס מראש חימם בינוני ESC.
3. להפשיר בקבוקון ESC ותאי זרע על גבי שכבת MEF. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, עד ESCs מגיע למפגש.
4. הכן מאכלי תרבית תאים חדשים המכילים בשכבה ומחוברת של MEFs. כדי הפרוזדור, ESCs, לשטוף פעם עם PBS ולנתק עם 0.25% טריפסין / EDTA במשך 2-5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% ₂ CO. עצור את trypsinization ידי הוספת IMDM טרי עם 15% FBS לתאים ניתוק, להעביר את ההשעיה התא צינור 15 מ"ל, ו צנטריפוגות ב 160 XG במשך 5 דקות ב RT.
5. הסר את supernatant, ESCs גלול עם IMDM הטרי מעבר חמישי של תאים לכל צלחת MEF מצופית חדשה; לדגור עד תאיםמגיע למפגש (בדרך כלל 4-5 ימים).

3. משוך MEFs ו ESCs תרבות על צלחות ג'לטין מצופה

1. לאחר ECSs הגיע המפגש, לנתק אותם MEFs עם 0.25% טריפסין / EDTA כמו בשלב 2.4, resuspend התאים IMDM טריים, מעבירים לצלחת פטרי בקטריולוגית הלא דביק, דגירה במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. להעביר בזהירות ESCs ו MEFs המכילים בינונית לצלחת ג'לטין מצופים חדשה בעזרת פיפטה מיליליטר 5, הימנעות pipetting חזר. התאים הנותרים בצלחות פטרי הם MEFs, מאז ESCs לא ידבקו.
3. המסדרון, ESCs כל 3-4 ימים. פחות passaging התכוף עשוי להפחית מגוונת" ESC. אין לעבור 60% המפגש, כפי שהוא עשוי להעדיף בידול.
4. חזור על שלבי 3.2-3.3 שלוש פעמים או יותר, כנדרש, עד MEFs הם כבר לא ניתן לגילוי על ידי מיקרוסקופ תרבית תאים, באמצעות מטרת 20X, לעשות MEFs בטוח אינו נוכח.
5. ודא מגוונת" ESC ידי בדיקת ESCהתרבות לראות אם התאים יוצרים מושבות צפופות עם מורפולוגיה מצולעים טיפוסית ESC (איור 1A). Stemness מבחן התא על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טרנסקריפטאז כמותי הפוך (qRT-PCR) ^17, immunoblotting ^17, או immunofluorescence של שעתוק מגוונת" הליבה גורמי ¹⁷ (איור 2).

4. גיבוש EB

1. הכן פתרון המניות כל-טרנס-RA ב 10 מ"מ ב DMSO, ו aliquot לתוך 1.5 מ"ל אור-מוגנים צינורות microfuge. הפתרון הוא יציב ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. להגן עליו מפני אור.
2. Trypsinize ESCs כמו בשלב 2.4; replate ב IMDM הטרי ללא LIF, כמו השעית תא בודד.
3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ולהכין 5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל ההשעיה ב IMDM עם 0.5 מיקרומטר RA.
4. פלייט 100 20-μL-טיפות לכל צלחת פטרי 100 מ"מ עם פיפטה 8 ערוצים ו 200 טיפים μL, הפוךהמנות, ולמלא את המכסה ההפוכה עם PBS כדי למנוע טיפות תלויות לייבוש. הגן על תקשורת ותרבות RA-המכיל מאור.
5. תרבות EBS ב תלוי טיפות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, עבור 4 ימים.

5. 2D EB תרבות

1. מעיל 12 מ"מ זכוכית עגול coverslips עם 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין עבור 30 דקות ב RT. מניחים כל coverslip בתוך באר של צלחת 24-היטב, ולהוסיף 1 מ"ל IMDM לכל טוב.
2. קציר 3 יום שגודלו תלוי EBS טיפה אחת אחת עם 200 טיפים μL פיפטה וזרעי אותם על coverslips מצופה פיברונקטין, 20 EBS בכל טוב, תוך שימוש באותה טיפים פיפטה.
   הערה: EBS 3 ימים עדיפים על פני EBS 4 ימים כי הם דבקים יותר טוב coverslips.
3. המשך התרבות עם FBS IMDM-15% ללא LIF. החלף בינוני כל 3-4 ימים. אסוף את המדיום המשמש לניתוח חלבון הפרשה לפי צורך.

6. איתור של חלבונים המופרשים

1. העבר 500 μL של Medi EBאממ אל 10 מסננים צנטריפוגלי kDa-הסף, ספין על 20,000 XG במשך 60 דקות ב 4 ° C.
2. בדוק את המדיום הנותרים בתוך המסננים צנטריפוגלי כל 15-20 דקות כדי למנוע העשרה מוגזמת. עצור צנטריפוגה כאשר היקף המדיום הנותרים נפל ל 25 μL.
3. אסוף המדיום המרוכז הנותר לאחר היפוך מסנן ספינינג ב 160 XG ב 4 ° C, בעקבות הוראות היצרן.
4. זיהוי חלבונים המופרשים על ידי immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים ^17.

7. 3D EB תרבות

1. אסוף את EBS גדל במשך 4 ימים תלוי טיפות כפי שמתואר בשלב 5.2, ומניחים אותם 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל (30 EBS לכל צינור).
2. כן פתרון ג'ל קולגן ביצוע ההוראות של ערכת תרבות קולגן 3D (ראה חומרים / טבלת ציוד). לדלל כרכים מתאימים של פתרון קולגן 5x DMEM (רכיב ערכה); מוסיפים את nפתרון eutralization (רכיב ערכת) ומערבבים היטב מיד, ולשמור על הקרח.
3. פיפטה נפח מתאים של פתרון קולגן מצונן לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל את EBS, בעדינות להעביר בארות צלחת 6-היטב באמצעות קצה פיפטה מ"ל 1. הימנע עושה בועות.
4. מיד להעביר את הצלחת 37 ° C, 5% CO _2, עבור 60 דקות ליזום פילמור קולגן.
5. מכסים את צלחת EB-המכיל עם IMDM.
6. שנה בינונית כל 3-4 ימים.

8. EB דיסוציאציה

1. אסוף היום 4 EBS (משלב 4) אחד אחרי השני, עם 200 טיפים μL פיפטה ולהעביר אותם IMDM המכיל בצלחת פטרי בקטריולוגית הלא דביק עם 15% FBS; תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 4 ימים נוספים. בדוק את EBS פעמים בכל יום, כדי לוודא שהם אינם מייחסים התחתונים; בעדינות לנער את המנה כדי למנוע עיקול EB לתחתית.
2. צנטריפוגה EBS ב 185 XG במשך 5 דקות בRT, בצנטריפוגה המעבדתיים.
3. הסר את supernatants. הגלולה לא תעלה על 100 μL בצינור אחד.
4. הוסף pelleted EBS 1 מ"ל 0.25% מסוג I Collagenase לכל צינור, בתוספת FBS 20% ב PBS.
5. דגירה את התערובת EB-collagenase עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, pipetting אותו בכל דקה 20 בעדינות, בעזרת 1 טיפים פיפטה מ"ל.
6. שוטפים את התאים בעדינות 3x עם PBS. אם אגרגטים התא נמצאים, להשתמש מסננת תא עם רשת 100 מיקרומטר כדי להסיר אותם.
7. Replate התאים על מנות ג'לטין מצופה 60 מ"מ IMDM. ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

9. Transfection של ניתק EBS

1. עבור qRT-PCR ו immunoblotting, מעיל צלחת 6-היטב עם 0.5% ג'לטין.
2. עבור immunofluorescence, זכוכית coverslips מעיל עם 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין עבור 30 דקות ב RT. מניחים כל coverslip בתוך באר של צלחת 24-היטב. להוסיף IMDM.
3. זרע 4.75 x 10 ⁵ או 1 x 10 ⁵ תאים ניתק EB (צעדים 8.4-8.7) לכל היטב 6- או צלחות 24-היטב, בהתאמה.
4. לגדל את התאים 70% המפגש לפני transfection.
5. Transfect התאים על ידי ריאגנט שומני nonliposomal תאי גזע-אופטימלי ¹⁷ (ראה חומרים / טבלת ציוד), בעקבות הוראות היצרן.
   הערה: ריאגנט השתמשנו בדרך כלל הגיעו יעילות transfection של 50% (ראה תוצאות נציג).
6. ניתוח דגימות ידי qRT-PCR או על ידי immunoblotting ¹⁷ 2 או 3 ימים לאחר transfection, בהתאמה.

ניתוח 10. בידול EB ידי Immunofluorescence

1. EBS 2D Wash או ניתק 3D EBS עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% ב PBS עבור 30 דקות ב RT. שוטף את התאים הקבועים 3x עם PBS להסיר צף פסולת תא.
   הערה: Paraformaldehyde הוא מטרד עור ועיניים; לנקוט זהירות בעת טיפול זה.
2. להוסיף 1% Triton X-100 ב PBS כדי permeabilize התאים עבור 20 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS.
3. הסר PBS ולחסום עם 5% BSA ב PBS עבור 30 דקות.
4. הכן דילול נוגדן ראשוני 1% BSA / PBS בתוספת טריטון 0.03% X-100. החלף את הפתרון חוסם ידי פתרון הנוגדן הראשוני. דגירה של 3 שעות ב RT, או לילה ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף תאים 3X עם PBS.
5. החל נוגדנים משני PBS על פי הוראות היצרן. דגירה של 1 ש 'ב RT, ולאחר מכן לשטוף תאים 3x עם PBS.
6. Coverslips הר בשקופיות זכוכית עם מדיום אנטי לדעוך למיקרוסקופיה אופטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Oct4, Nanog, ו Sox2 הם גורמי שעתוק הליבה המקנות התחדשות עצמית מגוונת" ESC. יישמנו בפרוטוקול לעיל כדי להשוות את הבידול העצבי של ESCs מן סוג בר מן זן של עכברים גנטיים השונים שבו Syx, גן המקודד את גורם RhoA הספציפי החילופי Syx, מופר. אנחנו סבכנו Syx ב אנגיוגנזה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה יחסית ללמוד בידול עצבי של ESCs בעכברים. בשנת הפרוטוקולים קודמים, RA נוספה המדיום ביום 2 או יום 4 של הירידה התלויה-EB ⁸ או על ידי השעית תרבות ^7, בהתאמה, או מייד לאחר EB תלוי צבירת ירידת ^21. בפרוטוקו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging