Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Riepilogo

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Abstract

Le cellule staminali embrionali di topo (CES) isolati dalla massa interna della blastocisti (tipicamente a giorno E3.5), può essere utilizzato come sistema modello in vitro per lo studio sviluppo embrionale precoce. In assenza di fattore inibitorio della leucemia (LIF), CES differenziano per default in cellule precursori neurali. Essi possono essere ammassati in una tridimensionale (3D) aggregato sferico definito corpo embrioide (EB) a causa della sua somiglianza con l'embrione in fase iniziale. EBs possono essere seminati su vetrini fibronectina rivestite, dove si espandono coltivando due estensioni (2D) dimensionali, o impiantati in matrici di collagene 3D dove continuano a crescere come sferoidi, e si differenziano in tre strati germinali: endodermica, mesoderma e ectodermica. La cultura collagene 3D simula l'ambiente in vivo più da vicino di EBS 2D. La cultura 2D EB facilita l'analisi per immunofluorescenza e immunoblotting per monitorare differenziazione. Abbiamo sviluppato una differenziazione neuronale in due fasiprotocollo zione. Nella prima fase, EBs sono generati dalla sospensione tecnica-drop, e, contemporaneamente, vengono indotte a differenziarsi da esposizione all'acido retinoico (RA). Nella seconda fase, neurali procede differenziazione in formato 2D o 3D in assenza di RA.

Introduzione

CES provengono dalla massa cellulare interna della blastocisti. Queste cellule sono pluripotenti, cioè hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula dell'organismo di origine. ESC differenziazione in vitro è di grande interesse, come un sistema sperimentale per studiare percorsi e meccanismi di sviluppo. Offre un potente e flessibile sistema modello per la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici per la correzione della disfunzione delle cellule e dei tessuti. EBs ricapitolano molti aspetti della differenziazione cellulare durante l'embriogenesi precoce. In particolare, EBs possono essere utilizzati quando letalità embrionale rende difficile determinare la base cellulare dei difetti embrionali ^{1, 2.} EBs possono essere formate mediante la goccia sospesa o tecniche sospensione liquida ^3. Il vantaggio del primo è la capacità di generare EBS di dimensioni e densità costante, facilitando così la riproducibilità sperimentale.

interazione con proteine ​​di adesione extracellulari della matrice (ECM) può influenzare la motilità e la sopravvivenza delle cellule aderenti. Nel sistema di coltura 2D, fibronectina è spesso applicato per aumentare l'adesione delle cellule al substrato. Fibronectina è un componente lamina basale riconosciuto da 10 tipi di superficie cellulare integrine eterodimeri ^4.

RA è una piccola metabolita della vitamina A lipofilo che induce neurale differenziazione ^{5, 6.} Elevate concentrazioni di RA promuovere genica neurale e reprime l'espressione genica mesoderma durante la formazione EB ^{7, 8.} RA è prodotto da vitamina A ossidazione retinaldehyde da uno o alcol deidrogenasi retinolo, seguita da ossidazione retinaldehyde al prodotto finale retinaldehyde deidrogenasi ^9. differenziazione neurale richiede il trasporto di RA dal citoplasma al nucleo da cellule RA-binding protein 2 (CRABP2). Nel nucleo, RA si lega al suo recettore affine costituito da un eterodimero RAR-RXR ^10. Ciò si traduce nel reclutamento di co-attivatori trascrizionali, e l'inizio della trascrizione ^{9, 11.} Inoltre, RA promuove la degradazione di fosforilato (attivo) SMAD1, contrapponendosi così BMP e SMAD segnalazione ^12. Oltre a queste attività, RA aumenta l'espressione di Pax6, un fattore di trascrizione che supporta neurale differenziazione ^13. Segnalazione RA è modulata da sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleotide adenina nicotinammide nucleare (NAD +) - enzima dipendente che deacetylates CRABP2, interferendo con la sua traslocazione al nucleo, e quindi con RA legame al eterodimero RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> Il nostro obiettivo nella progettazione del protocollo EB RA-trattati qui descritto è quello di ottimizzare la differenziazione neuronale al fine di facilitare l'analisi in vitro delle vie di segnalazione che regolano la differenziazione ESC in cellule precursori neuronali. Uno dei vantaggi di questo protocollo è facilitazione l'analisi della funzione delle cellule mediante immunofluorescenza. 3D EBs non sono ben penetrato da anticorpi e sono difficilmente immagine. EB dissociazione in un monostrato 2D in punti temporali specifici durante la differenziazione neuronale facilita immunomarcatura e l'imaging delle cellule mediante microscopia confocale.

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Protocollo

1. Cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF)

1. Preparare mezzo MEF, mezzo di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM, high-glucosio), supplementato con siero fetale bovino 15% (FBS).
2. Cappotto 100 mm piatti di coltura di cellule con soluzione di gelatina allo 0,5% per 30 min a temperatura ambiente (RT).
3. Conte MEF usando un citometro. Rimuovere la soluzione di gelatina e versare immediatamente medio MEF pre-riscaldato a 37 ° C. Scongelare rapidamente fiale di mitomicina C MEF trattata in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 minuti, quindi seminare 2,8 x 10 ⁶ MEF per ogni 100 mm piatto di gelatina rivestita. Regolare il numero di cellule di conseguenza se utilizza piatti di altre dimensioni. Incubare MEF notte a 37 ° C, 5% CO _2.
4. Cambiare il medio il giorno successivo. Cultura per 2-3 giorni fino a quando lo strato MEF è confluente.

2. topo Cultura ESC

1. Preparare mezzo ESC, modificata mezzo di Dulbecco Iscove (IMDM) supplementato con 15% FBS e 103 U / mL fattore leucemia inibitorio (LIF), 0,1 mM acidi non essenziali amino, 55 mM 2-mercaptoetanolo, penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 ug / mL), gentamicina (200 ug / mL), e 0,2% micoplasma antibiotico.
2. Rimuovere mezzo MEF dal piatto preparato nel passaggio 1 e sostituirla con 37 ° C media ESC pre-riscaldato.
3. Scongelare una fiala ESC e alveoli sulla sommità dello strato MEF. Incubare a 37 ° C, 5% di CO _2, fino a raggiungere la confluenza CES.
4. Preparare nuovi piatti di coltura di cellule contenenti un monostrato confluente di MEF. Per il passaggio CES, lavare una volta con PBS e staccare con 0,25% tripsina / EDTA per 2-5 minuti a 37 ° C, 5% CO _2. Interrompere la tripsinizzazione aggiungendo IMDM fresco con 15% FBS alle cellule distacco, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 160 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere il surnatante, risospendere CES con IMDM fresco e un quinto passaggio delle cellule ad ogni nuovo piatto MEF rivestite; incubare fino celluleraggiungere la confluenza (tipicamente 4-5 giorni).

3. Prelevare MEF e CES coltura su piastre rivestiti di gelatina

1. Una volta ECSS raggiunto confluenza, loro e MEF staccare con 0,25% tripsina / EDTA come al punto 2.4, risospendere le cellule in IMDM fresco, trasferire ad un batteriologico Petri non adesivo e incubare per 40 min a 37 ° C, 5% CO _2.
2. trasferire accuratamente CES e MEF contenente mezzo di una nuova piastra di gelatina rivestita con una pipetta ml 5, evitando ripetuto pipettaggio. Le cellule rimanenti nelle piastre di Petri sono MEF, poiché CES non aderiscono.
3. Passage i CES ogni 3-4 giorni. Meno passaging frequente può ridurre ESC pluripotenza. Non superare il 60% di confluenza, in quanto può favorire la differenziazione.
4. Ripetere i passi 3.2-3.3 tre volte o più, come richiesto, fino MEF non sono più visibili con un microscopio coltura cellulare, utilizzando un obiettivo 20X, per assicurarsi MEF non sono presenti.
5. Verificare ESC pluripotenza controllando ESCcultura per vedere se le cellule formano colonie dense tipica morfologia poligonale ESC (Figura 1A). Stemness cella di prova mediante reazione quantitativa inversa a catena della polimerasi transcriptasi (qRT-PCR) ^{17, 17} immunoblotting, o immunofluorescenza di trascrizione nucleo pluripotency Fattori ¹⁷ (Figura 2).

4. Formazione EB

1. Preparare tutto-trans-RA soluzione madre a 10 mM in DMSO, e aliquote in provette da 1,5 microcentrifuga luce protetto mL. La soluzione è stabile a -80 ° C per un massimo di due settimane. Proteggere dalla luce.
2. Trypsinize CES come nel passaggio 2,4; replate in IMDM fresco senza LIF, come cella singola sospensione.
3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare un 5 x 10 ⁵ cellule / ml sospensione in IMDM con 0,5 uM RA.
4. Piastra 100 di 20 microlitri-gocce per 100 mm di Petri con una pipetta a 8 canali e 200 microlitri suggerimenti, invertitoi piatti, e riempiono il coperchio invertita con PBS per evitare cadute appeso da essiccazione. Proteggere terreni di coltura RA contenenti dalla luce.
5. Cultura EBS appeso scende a 37 ° C, 5% di CO _2, per 4 giorni.

5. 2D Cultura EB

1. Cappotto 12 mm vetrini circolare con 30 ug / ml di fibronectina per 30 minuti a RT. Luogo ogni vetrino in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti, e aggiungere 1 ml IMDM per pozzetto.
2. Harvest 3 giorni-grown appeso EB goccia uno ad uno con 200 microlitri punte per pipette e semi sui vetrini fibronectina rivestite, 20 EBs per pozzetto, usando gli stessi puntali delle pipette.
   NOTA: 3 giorni EB sono preferibili over EBs 4 giorni perché aderiscono meglio alle lamelle.
3. Continuare con la cultura IMDM-15% FBS senza LIF. Sostituire media ogni 3-4 giorni. Raccogliere il mezzo utilizzato per l'analisi secrezione della proteina come necessario.

6. Rilevazione di secreto proteine

1. Trasferire 500 ml di EB Medium a 10 filtri centrifughi kDa-cutoff, centrifugare a 20.000 xg per 60 min a 4 ° C.
2. Esaminare il mezzo rimanente all'interno dei filtri centrifughi ogni 15-20 minuti per evitare eccessivo arricchimento. Interrompere centrifugazione quando il volume del mezzo rimanente è scesa a 25 microlitri.
3. Raccogliere il mezzo concentrato rimanente dopo l'inversione del filtro e centrifugazione a 160 xg a 4 ° C, seguendo le istruzioni del produttore.
4. Rilevare le proteine secrete da immunoblotting con anticorpi specifici ^17.

7. 3D Cultura EB

1. Raccogliere EBS coltivate per 4 giorni in appeso gocce come descritto al punto 5.2, e metterli in provette da 1,5 ml per centrifuga (30 EBS per provetta).
2. Preparare la soluzione gel di collagene seguendo le istruzioni del kit cultura collagene 3D (vedi Materiali / attrezzature Table). Diluire volumi appropriati di soluzione di collagene e 5x DMEM (un componente del kit); aggiungere il nsoluzione eutralization (un componente del kit) e mescolare bene immediatamente, e mantenere questo sul ghiaccio.
3. Pipettare un volume appropriato di soluzione di collagene raffreddata nella provetta ml 1,5, contenente l'EBS, e trasferire delicatamente per i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti utilizzando un 1 mL punta della pipetta. Evitare di fare bolle.
4. Trasferire immediatamente la piastra a 37 ° C, 5% di CO _2, per 60 minuti per iniziare la polimerizzazione del collagene.
5. Sovrapporre la piastra EB contenente IMDM con.
6. Cambiare media ogni 3-4 giorni.

8. EB Dissociazione

1. Raccogliere il giorno 4 EBS (passaggio 4) una ad una, con 200 microlitri punte delle pipette e trasferirli ad un non adesivo batteriologico capsula di Petri contenenti IMDM con il 15% FBS; coltura a 37 ° C, 5% CO ₂ per altri 4 giorni. Controllare l'EBs due volte al giorno per assicurarsi che essi non attribuiscono al fondo; agitare delicatamente piatto per evitare attaccamento EB al fondo.
2. Centrifugare EBS a 185 xg per 5 minuti aRT, in una centrifuga da banco.
3. Rimuovere il surnatante. Il pellet non deve superare i 100 microlitri in ciascun tubo.
4. Aggiungere al pellettato EB 1 mL tipo 0,25% I collagenasi per provetta, supplementato con 20% FBS in PBS.
5. Incubare la miscela EB-collagenasi per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO _2, pipettando delicatamente ogni 20 min, usando 1 ml di puntali delle pipette.
6. Lavare le cellule delicatamente 3x con PBS. Se aggregati di cellule sono presenti, utilizzare un filtro cella con una maglia di 100 micron per rimuoverli.
7. Replate le cellule su una gelatina rivestita piatti 60 mm in IMDM. Incubare a 37 ° C, 5% CO _2.

9. La trasfezione di dissociato EBs

1. Per qRT-PCR e immunoblotting, cappotto una piastra da 6 pozzetti con 0,5% di gelatina.
2. Per immunofluorescenza, vetrini cappotto con 30 ug / ml di fibronectina per 30 minuti a RT. Luogo ogni vetrino in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere IMDM.
3. Seme di 4,75 x 10 ⁵ o 1 x 10 ⁵ dissociate cellule EB (passi 8,4-8,7) per pozzetto in 6- o 24 pozzetti, rispettivamente.
4. Crescere le cellule al 70% di confluenza prima della trasfezione.
5. Trasfezione delle cellule da un nonliposomal lipidi reagente di cellule staminali-ottimale ¹⁷ (vedi Materiali / attrezzature Table), seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Il reagente abbiamo usato tipicamente raggiunge un'efficienza di trasfezione del 50% (vedi Rappresentante dei risultati).
6. Analizzare i campioni mediante qRT-PCR o mediante immunoblotting ¹⁷ 2 o 3 giorni dopo la trasfezione, rispettivamente.

Analisi 10. EB Differenziazione in immunofluorescenza

1. Lavare 2D EBs o dissociato EBs 3D con PBS e fissare con 4% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule fissate 3x con PBS per rimuovere i detriti cellulari galleggiante.
   NOTA: Paraformaldeide è una pelle e irritante per gli occhi; usare cautela nel maneggiarlo.
2. Aggiungere 1% Triton X-100 in PBS per permeabilize le cellule per 20 minuti a RT, poi lavare 3x con PBS.
3. Rimuovere PBS e bloccare con 5% BSA in PBS per 30 min.
4. Preparare diluizione anticorpo primario in 1% BSA / PBS integrato con 0,03% Triton X-100. Sostituire la soluzione bloccante dalla soluzione anticorpo primario. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C, poi lavare le cellule 3X con PBS.
5. Applicare anticorpo secondario in PBS in base alle istruzioni del produttore. Incubare per 1 ora a RT, poi lavare le cellule 3x con PBS.
6. Monte coprioggetto su vetrini con un mezzo anti-sbiadimento per la microscopia ottica.

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Risultati

Oct4, Nanog, e SOX2 sono i fattori di trascrizione fondamentali che conferiscono ESC auto-rinnovamento e pluripotenza. Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per confrontare la differenziazione neuronale dei CES da wild type e da un ceppo di topi geneticamente modificati in cui Syx, un gene che codifica per il fattore di scambio RhoA-specifica Syx, è interrotta. Avevamo implicati Syx nell'angiogenesi ^18. Abbiamo notato differenze nei comportame...

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Discussione

In questo protocollo vi presentiamo un metodo relativamente semplice e accessibile per studiare la differenziazione neuronale dei CES murini. In precedenti protocolli, RA è stato aggiunto al mezzo al giorno 2 o 4 giorni della EB hanging-goccia ⁸ o coltura in sospensione ^7, rispettivamente, o immediatamente dopo l'EB appeso aggregazione goccia ^21. Nel protocollo abbiamo ideato, RA è stato aggiunto in precedenza. Nonostante l'introduzione an...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging