2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

要約

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。

要約

（典型的には、日E3.5で）胚盤胞の内部塊から単離されたマウス胚性幹細胞（ESC）は、初期胚発生を研究するためのin vitroモデル系として使用することができます。白血病抑制因子（LIF）の非存在下で、ESCの神経前駆細胞にデフォルトで分化します。彼らが原因初期段階の胚との類似性に球状凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれる3次元（3D）に集めことができます。 EBは、それらが2次元（2D）の拡張を成長させることによって展開ここで、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、またはそれらは球状体として成長し続けると、3つの胚葉に分化する3次元コラーゲンマトリックスに埋め込むことができる：内胚葉、中胚葉、および外胚葉。 3Dコラーゲン文化がより密接に、2DのEBより生体内環境を模倣します。 2D EB培養物は、分化を追跡するために、免疫蛍光法およびイムノブロッティングによる分析を容易にします。私たちは、二段階の神経differentiaを開発しましたションプロトコル。第1のステップでは、EBを、ハンギングドロップ法によって生成され、そして、同時に、レチノイン酸（RA）への曝露によって分化するように誘導されます。第二工程において、RAの非存在下での2Dまたは3D形式の神経分化が進行します。

概要

ESCは胚盤胞の内部細胞塊に由来します。彼らは起源の生物の任意の細胞型に分化する能力を持っている、すなわち、これらの細胞は、多能性があります。 ESC のin vitro分化は、発生経路とメカニズムを調べるための実験システムとして幅広い重要です。それは、細胞や組織の機能不全を補正するための新しい治療アプローチをテストするための強力かつ柔軟なモデルシステムを提供しています。 EBは、初期胚発生時の細胞分化の多くの側面を再現します。胚致死は難しい胚欠陥^1,2の細胞の基礎を決定することができる場合、特に、EBを使用することができます。 EBを懸滴または液体懸濁液技術³のいずれかによって形成することができます。前者の利点は、このように、実験の再現性を容易に、一貫したサイズおよび密度のEBSを生成する能力です。

細胞外マトリックス（ECM）接着タンパク質との相互作用は、付着細胞の運動性および生存に影響を及ぼし得ます。 2D培養システムにおいて、フィブロネクチンは多くの場合、基板への細胞接着を高めるために適用されます。フィブロネクチンは、細胞表面インテグリンヘテロ⁴の10種類によって認識される基底膜成分です。

RAは、神経分化^5,6を誘導するビタミンAの小さな親油性代謝物です。 RAの高濃度は、神経遺伝子の発現を促進し、EB形成の^7,8の間中胚葉遺伝子発現を抑制する。 RAは、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ⁹により最終製品にレチンアルデヒド酸化、続いてのいずれかでアルコールまたはレチノールデヒドロゲナーゼによってレチンアルデヒドへの酸化ビタミンAによって製造されます。神経分化は、細胞質からRAの輸送を必要としますセルラRA結合タンパク質2（CRABP2）によって核へ。核内で、RAは、RAR-RXRヘテロ二量体¹⁰からなるその同族受容体複合体に結合します。これは、転写コアクチベーターの動員、および転写^9、11の開始をもたらします。さらに、RAは、このようにBMPとSMAD ^{12シグナル}伝達拮抗、リン酸化（活性）SMAD1の分解を促進します。これらの活動に加えて、RAは、Pax6の発現、神経分化^13を支持する転写因子を増加させます。 RAシグナリングはサーチュイン1（SIRT1）、核ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD +）により変調される- CRABP2を脱アセチル化依存性酵素、核へのトランスロケーションを妨害し、したがってRAは、RAR-RXRヘテロダイマー^14,15に結合すると^{、 16。}

e_contentは">ここで説明するRA処理したEBのプロトコルを設計する際の我々の目標は、神経前駆細胞へのESCの分化を調節するシグナル伝達経路のin vitroでの解析を容易にするために、神経分化を最適化することである。このプロトコルの利点の一つの促進であります免疫蛍光法による細胞機能の分析。3DのEBが十分な抗体が貫通し、画像に困難であるれていない。EB解離2D単層に特定の時点で神経分化中には、共焦点顕微鏡による細胞の免疫標識及びイメージングを容易にします。

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プロトコル

マウス胚線維芽細胞の1文化（MEFの）

1. MEF培地中、15％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース）を、準備します。
2. 室温（RT）で30分間0.5％ゼラチン溶液でコート100ミリメートル細胞培養皿を。
3. サイトメーターを使用したMEFを数えます。ゼラチン溶液を除去し、直ちに37℃に予め温めMEF培地を注ぎます。急速100mmのゼラチンコートディッシュあたり2.8×10 ⁶のMEFを播種次いで、2分間37℃の水浴中でマイトマイシンC処理したMEFのバイアルを解凍します。他のサイズのお皿を使用している場合はそれに応じて細胞数を調整します。 37°C、5％CO ₂で一晩のMEFをインキュベートします。
4. 翌日のメディアを変更します。 MEF層まで2-3日間培養が合流です。

2.マウスESC文化

1. 15％FBSおよび10を補充したESC培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）を調製3 U / mlの白血病抑制因子（LIF）、0.1mMの非必須アミノ酸、55mMの2-メルカプトエタノール、ペニシリン（100U / ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mLの）、ゲンタマイシン（200μgの/ mL）に溶解し、0.2％マイコプラズマ抗生物質。
2. ステップ1で調製した皿からMEF培地を除去し、37℃で予熱したESC培地で置き換えます。
3. MEF層の上にESCバイアルおよび種子細胞を解凍。 ESCがコンフルエンスに達するまで、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。
4. MEFののコンフルエントな単層を含む新しい細胞培養皿を準備します。通路へのESCは、PBSで1回洗浄し、37℃、5％CO ₂で2-5分間0.25％トリプシン/ EDTAを用いて取り外します。剥離細胞を、15％FBSを含む新鮮なIMDMを添加することによりトリプシン処理を停止し、15 mLの試験管に細胞懸濁液を転送し、そして室温で5分間、160×gで遠心分離。
5. 上清を除去し、それぞれの新しいMEFで被覆された皿への細胞の新鮮なIMDM通路五分の一でのESCを再懸濁。細胞までインキュベート（通常4〜5日）の合流に達します。

3.ゼラチンでコーティングされたプレート上のMEFと文化のESCを撤回

1. ECSSは、ステップ2.4のように0.25％トリプシン/ EDTAを用いてそれらとのMEFを切り離し、コンフルエンスに達した新鮮なIMDM中で細胞を再懸濁し、非接着細菌ペトリ皿に移し、37℃、5％COで40分間インキュベート後_2。
2. 注意深くESCを繰り返しピペッティングを回避5mLのピペットを用いて新たなゼラチンコートプレートにMEFを含有培地を移します。 ESCのが付着しないので、ペトリ皿に残った細胞は、MEFのです。
3. パッセージのESC 3〜4日毎に。あまり頻繁に継代はESCの多能性を減らすことができます。それは差別を好むこととして、60％の密集度を超えないようにしてください。
4. MEFのは確かのMEFが存在しないにするために、20Xの対物レンズを用い、細胞培養顕微鏡によってもはや検出されるまで繰り返して、必要に応じて、3.2から3.3まで3回以上のステップはありません。
5. ESCをチェックすることにより、ESCの多能性を確認してください細胞は、典型的なESC多角形形態（ 図1A）との密なコロニーを形成するかどうかを確認するために培養。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応^{（QRT-PCR）17}によってテストセル幹細胞性^、17をイムノブロッティング、またはコア多能性転写の免疫蛍光^17（ 図2）の要因に依存します。

4. EBの形成

1. DMSO中10mMでのオールトランスRAのストック溶液を調製し、そして1.5 mLのアリコートに光保護微量遠心管。解決策は2週間まで-80℃で安定しています。光から保護します。
2. ステップ2.4のようにトリプシン処理のESC;単一細胞懸濁液として、LIFを含まない新鮮なIMDMでreplate。
3. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、0.5μMのRAを有するIMDM中、5×10 ⁵細胞/ mLの懸濁液を調製します。
4. プレート100 8チャンネルピペットを用いて100 mmのペトリ皿当たり20μL-滴200μLのヒント、反転食器、乾燥からぶら下がっ滴を防ぐために、PBSで反転蓋を埋めます。光からRA含有培地を保護します。
5. ハンギング培養EBを、4日間、37℃、5％CO ₂で低下します。

5. 2D EB文化

1. RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンでコーティング12ミリメートルの円形カバーガラス。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置き、そしてウェル当たり1 mLのIMDMを加えます。
2. 収穫3日成長ドロップEBを200μLピペットチップとの一つずつをぶら下げと同じピペットチップを使用して、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にウェル当たり20のEBSをそれらをシード。
   注：彼らはカバースリップに良好に接着するので3日間のEBは、4日間のEB上で好ましいです。
3. LIFなしIMDM-15％FBSと文化を続行します。 3〜4日毎に培地交換してください。必要に応じてタンパク質分泌分析のために用いられる培地を収集します。

分泌タンパク質の6の検出

1. EBのメディの500μLを転送UMへの10kDaカットオフの遠心フィルタ、4°Cで60分間20,000×gでスピン。
2. 遠心フィルター内の過度の濃縮を防ぐために、すべての15-20分を残りのメディアを調べます。残りの培地の体積は25μlに低下したときに遠心分離を停止します。
3. 製造者の指示に従って、フィルタを反転し、4℃で160×gでスピンした後に残った濃縮培地を収集します。
4. 特異的抗体¹⁷を用いたイムノブロッティングによって分泌されるタンパク質を検出します。

7. 3D EB文化

1. ステップ5.2で説明したように懸滴中で4日間成長させたEBを収集し、そして1.5mLの遠心管（チューブ当たり30件のEB）に置きます。
2. （ 材料/機器の表を参照）、3Dコラーゲン培養キットの説明書に従ってコラーゲンゲル溶液を調製します。コラーゲン溶液と5×DMEM（キット構成要素）の適切な量を希釈します。 n個を追加eutralization溶液（キット構成要素）と、すぐによく混ぜ、氷の上にこれを維持します。
3. EBSを含む1.5mlチューブに冷却したコラーゲン溶液の適切な体積をピペット穏やか1mLのピペットチップを用いて、6ウェルプレートのウェルに移します。泡を作ることは避けてください。
4. 直ちにコラーゲンの重合を開始するために60分間、37°C​​、5％CO ₂にプレートを転送します。
5. IMDMでEBを含有するプレートを重ねます。
6. 3〜4日毎に培地交換。

8. EB解離

1. 200μlのピペットチップを用いて、一枚ずつ（ステップ4から）4日目のEBを収集し、15％FBSを有する非接着性細菌ペトリ皿を含有するIMDMに転送します。さらに4日間、37℃、5％CO ₂で培養。彼らは一番下に取り付けていないことを確認するために二回、毎日のEBを確認してください。穏やか底にEBの付着を防止するために、皿を振ります。
2. 5分間遠心185×gでのEBで卓上遠心機でRT、。
3. 上清を除去します。ペレットは、各チューブに100μLを超えてはなりません。
4. PBS中20％FBSを補充したIチューブ当たりコラゲナーゼEBを1mLの0.25％のタイプを、ペレット化するために追加。
5. 、37°C​​、5％CO ₂で1時間EB-コラゲナーゼ混合物をインキュベート1mLのピペットチップを使用して、穏やかに20分毎にそれをピペッティング。
6. PBSで穏やかに3倍の細胞を洗浄。細胞凝集体が存在している場合は、それらを削除するには、100ミクロンのメッシュでセルストレーナーを使用しています。
7. IMDMでゼラチン被覆の60mm皿に細胞をReplate。次いで、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。

解離EBの9.トランスフェクション

1. QRT-PCRおよび免疫ブロット法、0.5％ゼラチンでコート6ウェルプレートのために。
2. 免疫蛍光法、RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンで被覆ガラスカバースリップのために。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置きます。 IMDMを追加します。
3. シード4.75×10 ⁵または1×10 ⁵ それぞれ、6-または24ウェルプレートにウェル当たりEB細胞（8.4から8.7ステップ）を解離しました。
4. トランスフェクション前に70％コンフルエンスまで細胞を成長させます。
5. 製造業者の指示に従って、（ マテリアル/機器 の表を参照のこと）非リポソーム脂質幹細胞最適試薬¹⁷で細胞をトランスフェクトします。
   注：我々が使用した試薬は、一般的には50％のトランスフェクション効率に達した（ 代表的な結果を参照してください）。
6. QRT-PCRにより、または、それぞれ^、17 2、3日、トランスフェクション後に免疫ブロット法によってサンプルを分析。

免疫蛍光によってEB分化の10分析

1. 洗浄2DのEBまたはPBSで解離3D EBを、室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで固定します。固定された細胞は浮遊細胞残屑を除去するためにPBSで3回洗浄します。
   注：パラホルムアルデヒドは皮膚や眼への刺激性です。それを取り扱う際は注意してください。
2. その後、RTで20分間、細胞を透過性PBSで3回洗浄するPBS中1％トリトンX-100を加えます。
3. PBSを除去し、30分間PBS中5％BSAでブロックします。
4. 1％BSA中の一次抗体希釈液を調製/ PBS、0.03％のトリトンX-100を補いました。一次抗体溶液によってブロッキング液を交換してください。 RTで3時間インキュベート、または4℃で一晩、次いで細胞をPBSで3回洗浄します。
5. 製造元の指示に従ってPBSで二次抗体を適用します。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、RTで1時間インキュベートします。
6. マウントは、光学顕微鏡のための抗フェード媒体をガラススライド上にカバースリップ。

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結果

OCT4、Nanogの、およびSOX2は、ESCの自己再生および多能性を付与するコア転写因子です。我々は、野生型からとSYX、RhoAの特異交換因子SYXをコードする遺伝子は、破壊された遺伝子改変マウスの株からESCの神経分化を比較するために上記のプロトコルを適用しました。我々は、血管新生¹⁸でSYXを関与していました。 ESCは、および場合SYXの神?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、我々は、マウスESCの神経分化を研究するため、比較的簡単で、アクセス方法を提示します。以前のプロトコルでは、RA、または直ちにEBドロップ・アグリゲーション^21を吊り下げた後に、それぞれ、2日目又はEBのハンギングドロップ⁸又は懸濁培養⁷によるの4日目に培地に添加しました。私たちが考案したプロトコルで?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging