Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

Resumen

Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Resumen

En este estudio, se describe un protocolo abreviado fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. El detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) efectivamente solubiliza proteínas forma nativa plegadas en el tejido cerebral que permite el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de una amplia gama de proteinopatías neurodegenerativas, tales como Enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades priónicas. Control humano y los tejidos del cerebro post mortem AD fueron homogeneizadas y sedimentados por ultracentrifugación en presencia sarkosyl enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente incluyendo patológica tau fosforilada, el componente principal de ovillos enredos en AD. Western Blot demostró la solubilidad diferencial de agregados tau fosforilado y la proteína soluble en detergente, temprano Endosome antígeno 1 (EEA1) en control y el cerebro de AD. Análisis proteómico también revelaron enriquecimiento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) y apolipoproteína E (APOE) en las fracciones insolubles en sarkosyl de AD cerebral comparados con los de control, consistente con anteriores estrategias de fraccionamiento de tejido . Así, este Protocolo simple enriquecimiento es ideal para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde borrar occidental y funcional de la proteína ensayos de agregación Co proteómica basada en espectrometría de masa.

Introducción

Enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de prión estrechamente relacionados son proteinopatías caracterizada por la acumulación gradual de agregados de proteína insoluble en detergente en el cerebro con el acompañamiento cognitivo disminución. ^{1 , 2} esta característica patológica común se cree que desempeñan un papel central en la etiología y la patofisiología de estas enfermedades neurodegenerativas. ² estos agregados consisten en típicamente poliméricas fibras amiloides, que se componen de unidades de proteínas mal plegadas que Cruz β-estructura. ^{1 , 2 , 3 , 4} bioquímico, agregados amiloides son altamente resistentes a la desnaturalización térmica o química y solubilización,³ que presenta retos únicos para su purificación, análisis y estudian por medio de técnicas bioquímicas tradicionales. ^{2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} , la fracción de proteína insoluble en detergente ha sido el foco de mucha investigación en la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas que implica la acumulación de proteínas mal plegadas. ^{6 , 12 , 13 , 14}

Técnicas de fraccionamiento bioquímico a menudo han sido utilizadas para enriquecer la fracción insoluble en detergente de homogenados de cerebro post mortem. ^{6 , 12 , 13 , 14} uno de los métodos más comunes consiste en la extracción secuencial de homogenados de tejido con tampones y detergentes de aumentar rigor, seguido por ultracentrifugación para dividir las fracciones solubles e insolubles. Un protocolo comúnmente usado fraccionamiento secuencial^6,14 implica la homogeneización de las muestras de tejido congelado en un tampón libre de detergente bajo en sal (LS) y los pellets insolubles resultantes entonces son extraídos secuencialmente con buffers que contengan alta sal, detergentes no iónicos, alta sacarosa, detergentes iónicos y finalmente chaotropes como urea. ^{6 , 14} un inconveniente obvio de tales protocolos de fraccionamiento secuencial es el substancial del tiempo y el compromiso de la mano de obra necesaria para completarlos. Homogeneización y ultracentrifugación, un protocolo típico fraccionamiento de cinco pasos puede tomar varias horas o incluso días. ^{4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18} además, tantos agregados de proteína patológica permanecen insolubles en casi todos las más duras condiciones^19,20 la mayoría de las fracciones generadas son de valor limitado. Así, los pasos de fraccionamiento menos-rigurosos utilizando altas concentraciones de sal y detergentes no iónicos son en gran medida redundantes.

Estudios previos han demostrado que el detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) es un excelente candidato para un protocolo simplificado solo paso detergente fraccionamiento. ^{5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23} como un desnaturalización detergente sarkosyl es lo suficientemente estricta como para solubilizar la gran mayoría de proteínas de forma nativa plegadas en cerebro sin solubilización agregados de proteínas mal plegadas compuestos de beta-amiloide (Aβ),^6,11 tau fosforilada (pTau),⁶ proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43),¹⁴ alfa-sinucleína,^12,13 tembladera,²³ o U1 ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs U1) como U1 - 70 K. ^{5 , 21 , 22} Como sarkosyl es menos estricto que el dodecil sulfato de sodio detergente aniónico ubicua (SDS), conserva formas oligoméricas menos robustas de agregados de proteínas mal plegadas que no pueden soportar el tratamiento de la SDS. ⁹

Anteriormente, hemos descrito un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento que logra resultados comparables a la metodología de fraccionamiento secuencial más laboriosa. ⁵ por omitir las medidas menos estrictas de fraccionamiento, hemos sido capaces de desarrollar un protocolo de fácil fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. ⁵ este protocolo detallado descrito en este documento es adecuado para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde el Western Blot y análisis de proteómica basada en espectrometría de masa mal plegamiento de proteínas funcionales y siembra de agregación. ^{5 , 6 , 21}

Protocolo

declaración de ética: todos los tejidos del cerebro fueron obtenidos de la Emory de Alzheimer ' s enfermedad investigación centro (ADRC) Banco de cerebros. Tejidos humanos post mortem fueron adquiridos bajo adecuados protocolos de la Junta de revisión institucional (IRB).

1. homogeneización y fraccionamiento

1. selección de tejido
   Nota: congelados de tejido post mortem corteza frontal de control sano (Ctl) y patológico casos confirmados de AD fueron seleccionados de la Emory Banco de cerebros ADRC (n = 2). Evaluación neuropathological post mortem de la distribución de la placa amiloide fue realizada según el consorcio establecer un registro de Alzheimer ' s enfermedad semicuantitativo de puntuación criterios ²⁴, aunque patología neurofibrilares fue evaluado de acuerdo con el sistema de estadiaje de Braak. ¹⁶
   1. obtener congelados de tejido cerebral post mortem de control sano (Ctl) y patológico confirmó casos de AD. Utilizando contenedores de hielo seco, pinzas y una navaja, suprimir ~ porciones de 250 mg de materia gris de cada muestra de tejido en desechables previamente tarado pesan barcos, teniendo cuidado de evitar que el tejido descongelado. Registrar el peso de cada pieza a ser homogeneizado.
   2. Impuesto especial ~ 250 mg de materia gris usando pinzas y navajas por inspeccionar visualmente para localizar la interfaz entre el exterior materia gris y materia blanca interior. Evitar que la materia blanca y lo más importante, cualquier vasos sanguíneos o regiones sangrientas, meninges o aracnoides. Mantener el tejido congelado durante el proceso de corte trabajando rápidamente y con frecuencia colocando peso barco con tejido cerebral en contenedores de poliestireno con hielo seco
   3. Registrar el peso exacto de la materia gris de cada pieza congelada utilizando una balanza analítica. Calcular el volumen de tampón bajo en sal (LS) (ver tabla 1) necesarios para la homogeneización de dounce (5 mL/g o 20% w/v).
   4. Preparar 10 mL LS de tampón 1 x inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel y frialdad de hielo.
   5. Eliminar el tejido pesado y pesaje del barco de hielo seco y dados en trozos de aproximadamente 2 x 2 mm como deshiela. Transfiéralo a un tubo de homogeneizador de 2 mL dounce previamente enfriado en hielo.
   6. Añadir 5 mL/g (20% w/v) de tampón de helado bajo en sal (LS) con 1 X inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel.
   7. Homogeneizar el tejido de cerebro en hielo, mediante aproximadamente 10 movimientos de separación alta Maja A y 15 golpes de mortero de baja holgura B.
   8. Transferencia de homogeneizado de todos a un tubo de polipropileno de 2 mL con un pipeta Pasteur de vidrio. Etiquetar el tubo con “ TH ” (homogenado Total), el tejido del caso número y volumen de homogenado. alícuota 0,8 mL en un tubo de 1,5 mL etiquetado. Cualquier exceso homogeneizado puede ser semejantemente alícuotas y almacenados a -80 ° C.
   9. a cada 0,8 mL de alícuota, añada 100 μl de 5 M NaCl y sarkosyl 10% (p/v) a concentraciones de 0,5 y 1% w/v, respectivamente. Tubos de mezclar bien por inversión e incubar en hielo por 15 minutos los tubos etiqueta con " TH-S " (homogeneizado Total-Sarkosyl) para indicar que los homogenados en sarkosyl-buffer (tabla 1).
   10. Someter a ultrasonidos cada tubo de impulsos tres 5 s en amplitud de 30% en el hielo (intensidad máxima = 40%) utilizando una sonda de microtip.
   11. determinar las concentraciones de proteína de los homogenados del ácido bicinchoninic (BCA) ensayo ²⁵ método.
       Nota: La concentración promedio de proteína de TH S homogenados preparados en LS de 5 mL por gramo de tejido es 15-20 mg/mL. Los homogenados pueden ser fraccionada inmediatamente o almacenadas a-80 ° C hasta su uso.
   12. TH-S diluir homogenados a 10 mg/mL con buffer de sark helada (tabla 1) 1 x inhibidores de la proteasa y fosfatasa.
   Proteína de
   13. transferencia 5 mg (0,5 mL) de cada homogenado TH S en 500 μl policarbonato ultracentrífuga tubos y par-equilibrio con tampón de sark. Cargar tubos en un rotor previamente enfriada y ultracentrífuga a 180.000 x g durante 30 min en sobrenadantes de transferencia sarkosyl-soluble 4 ° C. (S1) para tubos de 1,5 mL y guardar a -80 ° C.
       Nota: (Lavado opcional) Añadir 200 μL de tampón de sark en la ultracentrífuga tubos que contienen las fracciones insolubles en detergente (P1) y desalojar los pellets (P1) de la parte inferior de los tubos de la ultracentrífuga utilizando una pipeta de 200 μl.
   Tubos de
   14. brevemente pulso spin la invertida para 2-3 s (≤ 2.500 x g) en una microcentrífuga para transferir el pellets (P1) y buffer a los tubos de 1,5 mL a continuación. Resuspender los gránulos insolubles (P1) en el búfer de sark transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de la pelotilla se interrumpe.
   15. El equilibrio de par y centrifugar a 180.000 x g durante un adicional 30 min a 4 ° C.
   16. Descarte el sobrenadante del lavado opcional (S2) e incubar los pellets sarkosyl insoluble (P2) en 50-75 μl de tampón de urea (cuadro 1) con 1 x PIC (inhibidor de proteasa y fosfatasa cóctel) durante 30 min a temperatura ambiente para solubilizar el pellets de.
       Nota: Urea caliente la memoria intermedia a la temperatura ambiente antes de su uso para evitar la precipitación de la SDS. Para aplicaciones sensibles al detergente, omitir SDS desde el búfer de urea y considerar lavado el precipitado insoluble (P2) en tampón salino bajo antes de resuspender en tampón urea.
   17. Transferir las pelotillas resuspendidas (P2) a tubos de 0.5 mL y uso breve (1 s) microtip sonicación en 20% de amplitud (intensidad máxima = 40%) para solubilizar completamente las pelotillas.
   18. Determinar las concentraciones de proteína del sarkosyl-soluble (S1) y - insolubles fracciones (P2) con el BCA método de ensayo. Utilice estas fracciones inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta su uso.

2. Immunoblotting

1. Western blotting
   Nota: borrar occidental fue realizado según los procedimientos previamente divulgados con leves modificaciones. ^{5 , 10}
   1. preparar 40 μg muestras de homogenados total (TH-S), soluble en sark (S1) y fracciones de sark-insoluble (P2) en el tampón de muestra Laemmli SDS-page de X 1 con pH de 5 mM TCEP 7. Incubar las muestras a 95 ° C por 5 min
   2. Carga de muestras en un prefabricado 10-pozo 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel. Electrophorese 80 V para el primer centímetro (10 min) y 120 V para el resto (60 min) o hasta que el tinte de seguimiento alcance la parte inferior del gel.
   3. Utilizar una nueva hoja de afeitar y un cuchillo de gel para split-abrir el cartucho de gel prefabricado. Con cuidado corte el peines y parte inferior del gel con una cuchilla de afeitar nueva.
   4. Volver a suspender los pellets insolubles (P1) en 200 μL de tampón de sark con 1 x PIC mediante pipeteo arriba y abajo.
   5. Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0.2 μm utilizando un método de transferencia en seco en una máquina de Blot (ver la tabla de materiales).
   6. Bloquear la membrana en solución amortiguadora de bloqueo (BB) sin Tween 20 durante 30 min, seguida con BB con 0,05% Tween 20 (BB/T) para 30 minutos. Después de bloquear, enjuagar la membrana en TBS/T (0,1% Tween 20) por 5 min eliminar el exceso de tampón bloqueo.
   1:1,000 de
   7. preparar diluciones de los anticuerpos primarios pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 y EEA1 en BB/T (0,05% Tween 20).
   8. Incubar las membranas en solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C con agitación circular. Enjuagar la membrana en TBS/T 3 x 15 min
   Anticuerpo secundario cercano-IR de
   9. punta de prueba de la membrana con una dilución de 1: 20.000 de la marcada con fluorescencia, en BB/T durante 60 min a temperatura ambiente en oscuridad en coctelera. Enjuagar la membrana para 3 x 10 min en TBS/T y 2 x 5 minutos en TBS.
   10. Analizar la membrana usando un infrarrojo sistema de la longitud de onda de excitación apropiada (por ejemplo 700 nm (canal rojo) para tinte infrarrojo 680 cabra anti-mouse IgG (H+L) secundaria y 800 nm (canal verde) para tinte infrarrojo 790 burro anti-rabbit IgG (H+L de imagen secundaria)).
   11. Uso del software de proyección de imagen para cuantificar la intensidades de la señal y realizar mediciones de densitometría según el fabricante ' instrucciones, asegurando el ajuste de auto-fondo se establece en promedio el fondo entero.

Resultados

El protocolo abreviado solo paso sarkosyl-fraccionamiento fue utilizado para enriquecer a agregados de proteína insoluble en detergente de control y cerebro post mortem AD (figura 1). Proteínas de fracciones TH S, S1, S2 y P2 fueron resueltas por SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie. El paso de resuspensión es opcional puesto que había niveles indetectable...

Discusión

En este documento presentamos y discutir un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento de solo paso que es aplicable a una amplia variedad de aplicaciones experimentales que van desde análisis de proteómica basada en espectrometría de masa al mal plegamiento de análisis funcional de la proteína y western blot. ^{5 , 6 , 7 , 10} esta metodología es más eficaz cuando se utiliza para el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)	Thermo Fisher	78441	protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)	Fisher Scientific	FB505110	microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361545	refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor	Beckman Coulter	362224	ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall	Beckman Coulter	343776	ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer	Home-made	N/A	SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH	Thermo Fisher	77720	reducing agent
(TBS) blocking buffer	Thermo Fisher	37542	blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20	Thermo Fisher	37543	blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well	Thermo Fisher	NW04120BOX	precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	B0002	SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)	Sigma Aldrich	L5777-50G	detergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody	Chemicon	MAB375	antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody	Millipore	MAB5450	antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)	Thermo Fisher	MN1020	antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody	abcam	ab2900	antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A21058	antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A11374	antibodies
iBlot2 Dry Blotting System	Thermo Fisher	IB21001	Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini	Thermo Fisher	IB23002	Gel transfer