Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Resumo

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Resumo

Neste estudo, descrevemos um protocolo abreviado fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. O detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) efetivamente solubiliza proteínas dobradas nativamente no tecido cerebral, permitindo o enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente de uma ampla gama de proteinopathies neurodegenerativas, tais como A doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica e doenças de príon. Controle humano e tecidos do cérebro após a morte de AD foram homogeneizadas e sedimentada por ultracentrifugação na presença de sarkosyl para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente incluindo tau fosforilada patológica, o componente do núcleo do tangles emaranhados em AD. Mancha ocidental demonstrou a solubilidade diferencial de agregados-tau fosforilada e a proteína solúvel em detergente, Early Endosome antígeno 1 (EEA1) no controle e no cérebro do AD. Análise proteômica também revelou o enriquecimento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) e apolipoproteína E (APOE) nas fracções sarkosyl insolúveis do cérebro AD comparados de controle, consistente com estratégias de fracionamento de tecido anterior . Assim, o presente protocolo simples enriquecimento é ideal para uma ampla gama de aplicações experimentais variando de mancha ocidental e proteína funcional ensaios de agregação co a espectrometria de massa-baseado proteomics.

Introdução

Doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ela) e as doenças de príon estreitamente relacionadas são proteinopathies caracterizadas pelo acúmulo gradual de agregados de proteína insolúvel em detergente no cérebro com acompanhamento cognitivo declinam. ^{1 , 2} este recurso compartilhado patológico é pensado para jogar um papel central na etiologia e fisiopatologia dessas doenças neurodegenerativas. ² estes agregados, normalmente, compostos de fibras de amiloides poliméricas, que são compostas de repetir unidades de misfolded proteínas exibindo Cruz β-estrutura. ^{1 , 2 , 3 , 4} bioquimicamente, agregados amiloides são altamente resistentes à desnaturação química ou térmica e solubilização,³ que apresenta desafios únicos para a sua purificação, análise e estudo através de técnicas bioquímicas tradicionais. ^{2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} não é novidade, a fração de proteína insolúvel em detergente tem sido o foco de muita pesquisa em fisiopatologia das doenças neurodegenerativas que envolvem o acúmulo de misfolded proteínas. ^{6 , 12 , 13 , 14}

Técnicas de fracionamento bioquímico frequentemente têm sido utilizadas para enriquecer a fração insolúvel em detergente de homogenates cerebral post-mortem. ^{6 , 12 , 13 , 14} um dos métodos mais comuns envolve a extração sequencial de tecido homogenates com buffers e detergentes de aumentar o rigor, seguido por ultracentrifugação para particionar as frações solúveis e insolúveis. Um protocolo comumente usado fracionamento sequencial^6,14 envolve a homogeneização de amostras de tecido congelado em um buffer de detergente livre baixo sal (LS) e as pelotas insolúveis resultantes então são extraídas sequencialmente com amortecedores que contêm sal elevado, detergentes não-iônicos, alta sacarose, detergentes iônicos e finalmente chaotropes como ureia. ^{6 , 14} uma desvantagem óbvia de tais protocolos um fracionamento sequencial é o tempo substancial e compromisso de trabalho necessário para concluí-las. Incluindo a homogeneização e ultracentrifugação, um protocolo típico de cinco etapas de fracionamento pode levar várias horas ou mesmo dias para completar. ^{4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18} além disso, como muitos agregados de proteína patológica permanecem insolúveis em todos, mas as mais adversas condições^19,20 a maioria das frações geradas são de valor limitado. Assim, as etapas de fracionamento menos rígidas utilizando altas concentrações de sal e detergentes não-iônicos são em grande parte redundantes.

Estudos anteriores mostraram que o detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) é um excelente candidato para um protocolo simplificado fracionamento de detergente de etapa única. ^{5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23} como um detergente de desnaturação, sarkosyl é suficientemente rigorosa para solubilizar a maioria vasta das proteínas nativamente dobradas no cérebro sem solubilizing agregados de misfolded proteínas compostos por beta-amiloide (Aβ),^6,11 tau fosforilada (pTau),⁶ TAR ADN-proteína obrigatória 43 (TDP-43),¹⁴ alfa-synuclein,^12,13 do tremor epizoótico,²³ ou U1 pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs U1) como U1 - 70 K. ^{5 , 21 , 22} Como sarkosyl é menos rigoroso do sulfato dodecyl de sódio detergente aniônico onipresente (SDS), preserva menos robustas oligoméricas formas de agregados de misfolded proteínas que não podem suportar o tratamento de SDS. ⁹

Anteriormente, nós descrevemos um protocolo de detergente-fracionamento Abreviado que obtiveram resultados comparáveis aos métodos de fracionamento sequencial mais trabalhosos. ⁵ , omitindo as menos rigorosas etapas de fracionamento, fomos capazes de desenvolver um protocolo facile fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. ⁵ este protocolo detalhado aqui descrito é bem adequado para uma ampla gama de aplicações experimentais que variam de mancha ocidental e ensaios de espectrometria de massa-baseado proteomics para enrolamento de proteína funcional e propagação de agregação. ^{5 , 6 , 21}

Protocolo

declaração de ética: todos os tecidos do cérebro foram obtidos a partir da Emory Alzheimer ' s doença Research Center (ADRC) banco de cérebro. Tecidos humanos após a morte foram adquiridos ao abrigo de protocolos apropriados institucional Review Board (IRB).

1. homogeneização e fracionamento

1. seleção de tecido
   Nota: congelado o tecido do córtex frontal após a morte de controle saudável (Ctl) e patologicamente casos confirmados de AD foram seleccionados a partir do Emory Banco de cérebro ADRC (n = 2). Post-mortem neuropatológica avaliação da distribuição de placa amiloide foi realizada de acordo com o consórcio para estabelecer um registro para Alzheimer ' s doença semi-quantitativa marcando critérios ²⁴, embora patologia do tangles emaranhado foi avaliada em conformidade com o sistema de preparo de Braak. ¹⁶
   1. obter congelado o tecido cerebral post-mortem de controle saudável (Ctl) e patologicamente confirmado casos de AD. Utilizando recipientes de gelo seco, fórceps e uma lâmina de barbear, impostos especiais de consumo ~ porções de 250 mg de matéria cinzenta de cada amostra de tecido na tarada descartável pesam barcos, tendo o cuidado de evitar que o tecido descongelar. Registrar o peso de cada peça para ser homogeneizado.
   2. Impostos ~ 250 mg de matéria cinzenta, usando a pinça e navalha, inspecionando visualmente para localizar a interface entre a substância cinzenta externa e interna de substância branca. Evitar a substância branca e, mais importante, qualquer grandes vasos sanguíneos ou regiões sangrentas, meninges ou aracnoide. Mantenha o tecido congelado durante o processo de corte a trabalhar rapidamente e frequentemente colocando o barco pesagem com tecido cerebral em recipientes de isopor com gelo seco
   3. Gravar o peso exato da matéria cinzenta extirpado da cada pedaço congelado usando uma balança analítica. Calcular o volume de tampão baixo sal (LS) (ver tabela 1) necessário para homogeneização de homogenizacao (5 mL/g ou 20% w/v).
   4. Preparar 10 mL LS de tampão com 1x do inibidor de protease e fosfatase cocktail e calma na Ice.
   5. Remover tecido pesado e pesagem do barco de gelo seco e corte em pedaços de 2 x 2 mm aproximadamente, enquanto ele derrete. Transferência para um tubo de homogeneizador de pre-refrigerados homogenizacao 2ml no gelo
   6. Adicionar 5 mL/g (20% w/v) do buffer de sal baixo gelada (LS) com 1 X coquetel de inibidor de protease e fosfatase.
   7. Homogenize no tecido cerebral no gelo usando aproximadamente 10 traços de alta apuramento pilão A e 15 golpes de pilão de depuração baixa B.
   8. Transferir tudo homogeneizado para um tubo de polipropileno 2 mL, usando um pipeta Pasteur de vidro. Rótulo do tubo com “ TH ” (Homogenate Total), o tecido caso número e homogeneizado volume. alíquota 0,8 mL num tubo rotulado 1,5 mL. Qualquer excesso homogenate pode ser similarmente aliquotadas e armazenado a -80 ° C.
   9. a cada 0,8 mL alíquota, adicionar 100 µ l cada de 5 M NaCl e sarkosyl de 10% (p/v) para as concentrações de 0,5 M e 1% p/v, respectivamente. Misturar os tubos bem pela inversão e incubar no gelo por 15 min. de tubos de rótulo com " TH-S " (Total homogeneizado-Sarkosyl) para indicar que o homogenates estão no buffer de sarkosyl (tabela 1).
   10. Proceda à sonicação cada tubo para pulsos de três 5 s em 30% amplitude no gelo (intensidade máxima = 40%) usando uma sonda de microtip.
   11. determinar as concentrações de proteína do homogenates usando o ácido bicinchoninic (BCA) ensaio ²⁵ método.
       Nota: A concentração de proteína média de TH-S homogenates preparado em 5 mL LS por grama de tecido é de 15-20 mg/mL. O homogenates pode ser fracionada imediatamente ou armazenado a-80 ° C até o uso.
   12. Homogenates TH-S diluir a 10 mg/mL, usando gelada sark buffer (tabela 1) com 1 x inibidores de protease e fosfatase.
   13. Transferir 5 mg proteína (0,5 mL) de cada homogenate TH-S em 500 tubos de se µ l em policarbonato e par-equilíbrio com buffer de sark. Carregar os tubos em um rotor pre-refrigerado e se a 180.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferência do sarkosyl-solúvel fracções sobrenadantes (S1) para tubos de 1,5 mL e armazene a -80 ° C.
       Nota: (Lavagem opcional) adicionar 200 µ l de sark-buffer para o se tubos contendo as frações insolúveis em detergente (P1) e desalojar as pelotas (P1) da parte inferior dos tubos se utilize uma ponta de pipeta de 200 µ l.
   Tubos
   14. brevemente de pulso-gire o invertido para 2-3 s (≤ 2.500 x g) em um microcentrifuge para transferir o buffer e pelotas (P1) para os tubos de 1,5 mL abaixo. Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) no buffer de sark pipetando para cima e para baixo para garantir a pelota é interrompida.
   15. Par-equilíbrio e centrifugar 180.000 x g por um adicional 30 min a 4 ° C.
   16. Desprezar o sobrenadante de lavagem opcional (S2) e incube as pelotas de sarkosyl insolúveis (P2) em 50-75 µ l de tampão de ureia (tabela 1) com 1 x PIC (protease e fosfatase inibidor cocktail) por 30 min à temperatura ambiente para solubilizar o pelota.
       Nota: Buffer de ureia quente a temperatura ambiente antes do uso para evitar a precipitação de SDS. Para aplicações sensíveis ao detergente, omitir SDS de buffer de ureia e considerar lavar o sedimento insolúvel (P2) no baixo sal buffer antes de resuspending no buffer de ureia.
   17. Transferir as ressuspensa Pelotas (P2) para tubos de 0,5 mL e usar breve (1 s) microtip sonication em amplitude de 20% (intensidade máxima = 40%) para solubilizar totalmente as pelotas.
   18. Determinar as concentrações de proteína de sarkosyl-solúvel (S1) e insolúveis (P2) frações usando o BCA método de ensaio. Use estas frações imediatamente ou armazenar a-80 ° C até o uso.

2. Immunoblotting

1. mancha ocidental
   Nota: mancha ocidental foi realizada de acordo com os procedimentos anteriormente relatados com ligeiras alterações. ^{5 , 10}
   1. preparar 40 µ g amostras de homogenates total (TH-S), sark-solúvel (S1) e frações de sark insolúveis (P2) em 1 amortecedor da amostra X Laemmli SDS-page com pH TCEP 5 mM 7. Incubar as amostras a 95 ° C por 5 min.
   Amostras de
   2. carga em SDS-PAGE um pré-moldado bem 10 4-12% Bis-Tris gel. Electrophorese em 80 V para o primeiro centímetro (10 min) e 120 V para o restante (60 min), ou até que a tintura de seguimento atinge a parte inferior do gel.
   3. Use uma lâmina de barbear fresca e gel de faca para dividir-abrir a gaveta do gel de pre-cast. Delicadamente cortar fora os pentes e inferior do gel com uma lâmina de barbear fresco.
   4. Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) em 200 µ l sark-buffer com 1x PIC pipetando cima e para baixo.
   5. Transferência para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 µm usando um método de transferência de seco em uma máquina de mancha (consulte a tabela de materiais).
   6. Bloquear a membrana em tampão de bloqueio (BB) sem Tween 20 por 30 min, seguida com BB com 0,05% Tween 20 (BB/T) por 30 min. Após o bloqueio, lavar a membrana em TBS/T (0.1% Tween 20) por 5 min remover o tampão de bloqueio excesso.
   7. Preparar diluições de 1:1,000 de pT231 os anticorpos primários, Tau-2 (pan tau), AT8 e EEA1 no BB/T (0,05% Tween 20).
   8. Incubar as membranas em solução de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, com agitação circular. Lavar a membrana em TBS/T 3 x 15 min.
   9. Sonda a membrana com uma diluição de 1: 20.000 de fluorescente-etiquetadas infravermelho próximo anticorpo secundário no BB/T para 60 min à temperatura ambiente na escuridão agitador. Lavar a membrana para 3 x 10 min na TBS/T e 2 x 5 min em TBS
   10. Scan a membrana usando um sistema no comprimento de onda de excitação apropriada (por exemplo, 700 nm (canal vermelho) para tintura infravermelho 680 cabra anti-rato IgG (H + L) secundário e 800 nm (canal verde) para tintura infravermelho 790 burro anti-rabbit IgG (H + L de imagens de infravermelho secundária)).
   11. Usar o software de imagem para quantificar a intensidade do sinal e executar medidas de densitometria conforme o fabricante ' instruções de s, garantir autoconfiguração de fundo é definido como média o fundo todo.

Resultados

O protocolo de sarkosyl de etapa única abreviado-fracionamento foi usado para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente de controle e o cérebro após a morte de AD (Figura 1). Proteínas de frações TH-S, S1, S2 e P2 foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250. A etapa de ressuspensão é opcional, desde que não ...

Discussão

Neste documento vamos apresentar e discutir um protocolo de detergente-fracionamento de etapa única Abreviado que é aplicável a uma ampla variedade de aplicações experimentais que variam de análise proteômica de espectrometria de massa-baseado a proteína funcional ensaios de enrolamento e mancha ocidental. ^{5 , 6 , 7 , 10} esta metodologia é talvez mais eficaz quando usado para estudar p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)	Thermo Fisher	78441	protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)	Fisher Scientific	FB505110	microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361545	refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor	Beckman Coulter	362224	ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall	Beckman Coulter	343776	ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer	Home-made	N/A	SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH	Thermo Fisher	77720	reducing agent
(TBS) blocking buffer	Thermo Fisher	37542	blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20	Thermo Fisher	37543	blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well	Thermo Fisher	NW04120BOX	precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	B0002	SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)	Sigma Aldrich	L5777-50G	detergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody	Chemicon	MAB375	antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody	Millipore	MAB5450	antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)	Thermo Fisher	MN1020	antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody	abcam	ab2900	antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A21058	antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A11374	antibodies
iBlot2 Dry Blotting System	Thermo Fisher	IB21001	Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini	Thermo Fisher	IB23002	Gel transfer