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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Abstract

In questo studio, descriviamo un protocollo abbreviato passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem. Il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) solubilizza efficacemente nativamente piegati proteine nel tessuto cerebrale permettendo l'arricchimento degli aggregati della proteina detersivo-insolubili da una vasta gamma di proteinopathies neurodegenerative, come Morbo di Alzheimer (annuncio), morbo di Parkinson e sclerosi laterale amiotrofica e malattie da prioni. Controllo umano e tessuti di cervello post mortem AD sono stati omogeneizzati e sedimentato di ultracentrifugazione in presenza di sarkosyl per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili tra cui tau fosforilata patologica, il componente principale di neurofibrillary grovigli in annuncio. Macchiarsi occidentale ha dimostrato la solubilità differenziale aggregati fosforilato-tau e la proteina detergente solubile, presto 1 antigene Endosome (EEA1) in controllo e cervello dell'annuncio. Analisi proteomica ha rivelato anche arricchimento di β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e l'apolipoproteina E (APOE) nelle frazioni sarkosyl-insolubile del cervello dell'annuncio rispetto a quelli di controllo, coerenza con le precedenti strategie di frazionamento del tessuto . Così, questo protocollo semplice arricchimento è ideale per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e funzionale della proteina saggi co-aggregazione a basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Introduzione

Malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e le malattie da prioni strettamente correlati sono proteinopathies caratterizzata dall'accumulo graduale di aggregati di detersivo-insolubili della proteina nel cervello con l'accompagnamento conoscitivo declino. 1 , 2 questa caratteristica patologica comune è pensata per svolgere un ruolo centrale nell'eziologia e patofisiologia di queste malattie neurodegenerative. 2 questi aggregati consistono tipicamente di fibre amiloidi polimeriche, che sono composti da unità di proteine misfolded espositrici Croce βripetute-struttura. 1 , 2 , 3 , 4 biochimicamente, aggregati amiloidi sono altamente resistenti alla denaturazione termica o chimica e solubilizzazione,3 che presenta sfide uniche per la loro purificazione, analisi e studiano tramite tecniche biochimiche tradizionali. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 non sorprende, la frazione di detersivo-insolubili della proteina è stato al centro di molte ricerche nella patofisiologia delle malattie neurodegenerative che coinvolgono l'accumulo di proteine misfolded. 6 , 12 , 13 , 14

Tecniche di frazionamento biochimici sono stati utilizzati spesso per arricchire la frazione di detersivo-insolubili da omogenati di cervello post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno dei metodi più comuni comporta l'estrazione sequenza degli omogeneati del tessuto con buffer e detergenti di crescente rigore, seguita da ultracentrifugazione di partizionare le frazioni solubili e insolubili. Un frazionamento sequenziale comunemente usato protocollo6,14 comporta l'omogeneizzazione di campioni di tessuto congelato in un buffer senza detersivo basso contenuto di sale (LS) e i pellet insolubili risultanti quindi vengono estratte in sequenza con buffer contenente sale alto, detergenti non ionici, alta saccarosio, detergenti ionici e infine chaotropes come urea. 6 , 14 un evidente svantaggio di tali protocolli di un frazionamento sequenziale è la notevole di tempo e l'impegno di lavoro necessario per completarle. Omogeneizzazione e ultracentrifugazione, un protocollo tipico cinque fasi frazionamento può richiedere diverse ore o anche giorni per completare. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 inoltre, aggregati di proteine patologiche come molti rimangono insolubili in tutti, ma le più dure condizioni19,20 la maggior parte delle frazioni generate sono di scarso valore. Così, i passaggi di meno-rigorosi frazionamento che utilizzano alte concentrazioni saline e detergenti non ionici sono in gran parte ridondanti.

Gli studi precedenti hanno dimostrato che il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) è un candidato eccellente per un protocollo semplificato passo singolo detergente frazionamento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 come un detergente denaturante, sarkosyl è sufficientemente rigorosi per solubilizzare la stragrande maggioranza delle proteine in modo nativo piegati nel cervello senza solubilizzanti aggregati di proteine misfolded composti di beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilata (pTau),6 TAR DNA-proteina 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 scrapie,23 o U1 piccole ribonucleoproteine nucleari (U1 snRNPs) come U1 - 70K. 5 , 21 , 22 Come sarkosyl è meno rigorose rispetto l'onnipresente anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS), conserva meno robuste forme oligomeriche di aggregati di proteine misfolded che non possono sopportare un trattamento di SDS. 9

In precedenza, abbiamo descritto un protocollo di detersivo-frazionamento abbreviato che ha raggiunto risultati paragonabili alle metodologie di frazionamento sequenziale più laboriose. 5 omettendo i passaggi meno rigorosi di frazionamento, siamo stati in grado di sviluppare un protocollo facile passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello umano. 5 questo protocollo dettagliato qui descritto è adatto per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e saggi basati sulla spettrometria di massa proteomica a funzionale misfolding e aggregazione semina. 5 , 6 , 21

Protocollo

etica istruzione: tutti i tessuti del cervello sono stati ottenuti da Emory Alzheimer ' s malattia Research Center (ADRC) Brain Bank. Tessuti umani post mortem sono stati acquisiti sotto protocolli appropriati Institutional Review Board (IRB).

1. omogeneizzazione e frazionamento

  1. selezione del tessuto
    Nota: Frozen tessuto corteccia frontale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico casi confermati di annuncio sono stati selezionati dalla Emory Banca di cervello ADRC (n = 2). Post mortem neuropathological valutazione della distribuzione della placca dell'amiloide è stato eseguito secondo il Consorzio di istituire un registro per Alzheimer ' s malattia semi-quantitativa segnando criteri 24, anche se patologia neurofibrillary di groviglio è stata valutata in conformità con il sistema di stadiazione di Braak. 16
    1. ottenere congelato tessuto cerebrale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico confermato casi di AD. Utilizzando contenitori di ghiaccio secco, pinze e una lama di rasoio, asportare ~ porzioni di 250 mg di materia grigia da ogni campione di tessuto su monouso tarato pesano barche, avendo cura di evitare che il tessuto dallo scongelamento. Registrare il peso di ciascun pezzo di omogeneizzati.
    2. Accise ~ 250 mg di sostanza grigia utilizzando forcipe e rasoio controllando visivamente per individuare l'interfaccia tra la materia grigia esterna e interna della materia bianca. Evitare di materia bianca e ancora più importante, qualsiasi grandi vasi sanguigni o regioni sanguinose, meningi o mater aracnoide. Mantenere il tessuto congelato durante il processo di taglio lavorando rapidamente e frequentemente posizionando barca pesatura con tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco
    3. Registra il peso esatto di materia grigia asportato da ogni pezzo congelato utilizzando una bilancia analitica. Calcolare il volume di tampone di basso contenuto di sale (LS) (Vedi tabella 1) necessaria per omogeneizzazione lisata (5 mL/g o 20% w/v).
    4. Preparare 10 mL LS tampone con 1x dell'inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail e chill sul ghiaccio.
    5. Rimuovere tessuto pesato e pesatura barca da ghiaccio secco e dadi pezzetti di circa 2 x 2 mm come si scioglie. Trasferimento a una provetta da 2 mL pre-refrigerati lisata omogeneizzatore su Ice.
    6. Aggiungere 5 mL/g (20% w/v) del buffer ghiacciata basso contenuto di sale (LS) con 1 X cocktail di inibitore della proteasi e fosfatasi.
    7. Omogenizzazione del tessuto di cervello sul ghiaccio con circa 10 colpi di clearance elevata pestello A e 15 colpi di pestello bassa clearance B.
    8. Trasferire tutti omogeneato ad un tubo in polipropilene da 2 mL utilizzando un pipetta Pasteur di vetro. Etichettare la provetta con “ TH ” (Totale omogeneato), il tessuto caso numero e volume omogeneato. aliquota 0,8 mL in una provetta con etichetta 1,5 mL. Qualsiasi omogeneato in eccesso può essere similmente aliquotati e conservati a -80 ° C.
    9. Per ogni aliquota di mL 0,8, aggiungere 100 µ l di 5 M di NaCl e sarkosyl 10% (p/v) a concentrazioni di 0,5 M e 1% w/v, rispettivamente. Tubi di mescolare bene capovolgendo e incubare in ghiaccio per 15 min. Etichettare provette con " TH-S " (Totale omogeneato-Sarkosyl) per indicare che gli omogeneati sono nel sarkosyl-buffer (tabella 1).
    10. Sonicare ogni tubo per gli impulsi di tre 5 s a 30% ampiezza sul ghiaccio (intensità massima = 40%) utilizzando una sonda microtip.
    11. determinare le concentrazioni di proteina degli omogeneati usando l'acido bicinconinico (BCA) dosaggio 25 Metodo.
      Nota: La concentrazione media di proteine degli omogeneati TH-S preparati alle LS da 5 mL per grammo di tessuto è 15-20 mg/mL. Gli omogeneati possono essere frazionati immediatamente o conservati a-80 ° C fino all'utilizzo.
    12. Omogeneati diluire TH-S a 10 mg/mL utilizzando ghiacciata sark buffer (tabella 1) con inibitori di proteasi e fosfatasi: 1x.
    13. Trasferire 5 mg proteina (0,5 mL) di ogni omogeneato TH-S in 500 µ l in policarbonato ultracentrifuga provette e coppia-equilibrio con buffer di sark. Caricare i tubi in un rotore pre-refrigerato e ultracentrifuga a 180.000 x g per 30 min a 4 surnatanti di trasferimento sarkosyl-solubile ° C. (S1) per provette da 1,5 mL e conservare a -80 ° C.
      Nota: (Lavaggio facoltativo) aggiungere 200 µ l di sark-tampone per l'ultracentrifuga tubi contenenti le frazioni di detersivo-insolubili (P1) e sloggiare i pellet (P1) dalla parte inferiore dei tubi ultracentrifuga utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.
      14. Tubi di
    14. brevemente impulso-spin invertito per 2-3 s (≤ 2.500 x g) in una microcentrifuga per trasferire il pellet (P1) e il buffer nelle provette da 1,5 mL qui sotto. Risospendere il pellet insolubile (P1) nel buffer di sark pipettando su e giù per assicurare il pellet è perturbato.
    15. Coppia-equilibrio e centrifugare a 180.000 x g per altri 30 min a 4 ° C.
    16. Scartare il surnatante di lavaggio opzionale (S2) e incubare i pellet sarkosyl-insolubile (P2) in 50-75 µ l di tampone di urea (tabella 1) con 1 x PIC (inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail) per 30 min a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet.
      Nota: Buffer di urea calda a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare la precipitazione di SDS. Per le applicazioni sensibili al detersivo, omettere SDS dal buffer di urea e considerare lavare il precipitato insolubile (P2) in basso tampone salino prima ematico nel buffer di urea.
    17. Trasferire il sedimento pellet (P2) in 0,5 mL provette e utilizzare breve (1 s) microtip sonicazione a 20% ampiezza (intensità massima = 40%) per solubilizzare completamente il pellet.
    18. Determinare le concentrazioni di proteina di sarkosyl-solubile (S1) e - metodo di analisi insolubile (P2) frazioni utilizzando la BCA. Utilizzare queste frazioni immediatamente o conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.

2. Immunoblotting

  1. Western blotting
    Nota: macchiare occidentale è stato eseguito secondo le procedure precedentemente segnalate con lievi modifiche. 5 , 10
    1. preparare 40 µ g campioni di totali omogeneati (TH-S), sark-solubile (S1) e le frazioni (P2) di sark insolubile nel buffer del campione di 1 X Laemmli SDS-page con pH compreso tra 5 mM TCEP 7. Incubare i campioni a 95 ° C per 5 min.
    2. Carico campione su una Bis-Tris 10 pozzetti prefabbricati 4-12% SDS-PAGE gel. Elettroforesi a 80 V per il primo centimetro (10 min) e 120 V per il resto (60 min) o fino a quando la tintura di rilevamento raggiunge il fondo del gel.
    3. Utilizzare una lama di rasoio fresco e gel coltello per Spalato-Apri il vassoio del gel prefabbricato. Tagliare delicatamente i pettini e il fondo del gel con una lama di rasoio fresco.
    4. Risospendere il pellet insolubile (P1) in 200 µ l di sark-tampone con 1 x PIC pipettando su e giù.
    5. Trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm utilizzando un metodo di trasferimento asciutto su una macchina macchiante (Vedi materiali tavolo).
    6. Bloccare la membrana in tampone bloccante (BB) senza Tween 20 per 30 min, seguita con BB con 0.05% Tween 20 (BB/T) per 30 min. Dopo il blocco, risciacquare la membrana in TBS/T (0.1% Tween 20) per 5 min rimuovere l'eccesso tampone bloccante.
    7. Preparare diluizioni di 1:1,000 della pT231 di anticorpi primari, Tau-2 (pan tau), AT8 ed EEA1 in BB/T (0.05% Tween 20).
    8. Incubare le membrane in soluzione di anticorpo primario durante la notte a 4 ° C con agitazione circolare. Lavare la membrana in TBS/T per un minimo di 3 x 15
    9. Sonda la membrana con una diluizione di 1: 20,000 di fluorescente-identificato vicino-IR anticorpo secondario in BB/T per 60 min a temperatura ambiente al buio su agitatore. Risciacquare la membrana per 3 x 10 min in TBS/T e 2 x 5 min in TBS.
    10. Scan la membrana utilizzando una porta a infrarossi imaging sistema alla lunghezza d'onda di eccitazione appropriato (ad es. 700 nm (canale rosso) per tintura infrarosso 680 capra anti-topo IgG (H + L) secondaria e 800 nm (canale verde) per tintura infrarosso 790 asino anti-rabbit IgG (H + L secondaria)).
    11. Utilizzare il software di imaging per quantificare l'intensità del segnale ed eseguire misurazioni densitometria secondo il produttore ' s istruzioni, assicurando auto-sfondo impostazione è impostata su media l'intero sfondo.

Risultati

Il protocollo abbreviato passo singolo sarkosyl-frazionamento è stato utilizzato per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili da controllo e cervello post mortem dell'annuncio (Figura 1). Proteine da frazioni TH-S, S1, S2 e P2 sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250. Il passo di risospensione è facoltativo in q...

Discussione

Qui introduciamo e discutere un protocollo di detersivo-frazionamento passo singolo abbreviato che è applicabile a una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno dall'analisi basati sulla spettrometria di massa proteomica funzionale proteina misfolding saggi e western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 questa metodologia è forse più efficace quando usato per studiare proteinopathies neurodegen...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano la d. ssa Jim Lah e Allan Levey, Emory dipartimento di neurologia, per suggerimenti e commenti utili. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Partnership di medicina accelerando concessione (U01AG046161-02), la Emory Alzheimer malattia Research Center (P50AG025688) e un Istituto nazionale su invecchiamento concedere (R01AG053960-01) di N.T.S Questa ricerca è stata anche sostenuta in parte dal nucleo della neuropatologia della sovvenzione Emory neuroscienze NINDS Core strutture, P30NS055077.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)Thermo Fisher78441protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)Fisher ScientificFB505110microtip ultrasonicator
Optimax TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361545refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotorBeckman Coulter362224ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwallBeckman Coulter343776ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample bufferHome-madeN/ASDS-PAGE
TCEP solution, neutral pHThermo Fisher77720reducing agent
(TBS) blocking bufferThermo Fisher37542blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20Thermo Fisher37543blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-wellThermo FisherNW04120BOXprecast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)Sigma AldrichL5777-50Gdetergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibodyChemiconMAB375antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibodyMilliporeMAB5450antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)Thermo FisherMN1020antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibodyabcamab2900antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA21058antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA11374antibodies
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, miniThermo FisherIB23002Gel transfer

Riferimenti

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