JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан сокращенное фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг.

Аннотация

В этом исследовании мы описываем сокращенное одноступенчатых фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг. Ионных моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) эффективно solubilizes изначально сложенном белков в ткани мозга, позволяя обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от широкий спектр нейродегенеративных proteinopathies, такие как Болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз и прионы заболеваний. Человеческого контроля и AD посмертных мозга тканей были гомогенизированные и осевших ultracentrifugation присутствии sarkosyl обогатить моющего средства нерастворимого белка агрегаты, включая патологическое фосфорилированных Тау, основной компонент нейрофибриллярных связок в AD. Западный blotting продемонстрировал дифференциального растворимость агрегированных фосфорилированных Тау и моющих средств растворимого белка, раннего Endosome Antigen 1 (ЕЕА1) управления и AD мозга. Протеомного анализа также выявлено обогащение β-амилоида (значения), Тау, snRNP70 (U1 - 70 K) и аполипопротеина Е (АРОЕ) в sarkosyl нерастворимые фракций AD мозга по сравнению с теми из элемента управления, в соответствии с предыдущей стратегии фракционирование ткани . Таким образом этот протокол простого обогащения идеально подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и функциональных белков Сопредседатель агрегации анализов массы на основе спектрометрии протеомики.

Введение

Нейродегенеративные заболевания, как болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезни Гентингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и тесно связанных прионных заболеваний являются proteinopathies, характеризуется постепенным накоплением агрегатов моющего средства нерастворимого белка в головном мозге с сопутствующими когнитивных снижаться. 1 , 2 считается, что эта общая патологическая функция играть центральную роль в этиологии и патофизиологии этих нейродегенеративных заболеваний. 2 эти агрегаты обычно состоят из полимерных волокон амилоида, которые состоят из повторяющихся звеньев смятых протеинов экспонирования крест β-структуры. 1 , 2 , 3 , 4 биохимически, амилоида агрегаты обладают высокой устойчивостью к химическим или тепловой денатурации и солюбилизация,3 , который представляет уникальные проблемы для их очистки, анализ и исследование через традиционные биохимические методы. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 неудивительно, что моющее средство нерастворимые белковые фракции был в центре внимания многочисленных исследований в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, связанных с накоплением смятых протеинов. 6 , 12 , 13 , 14

Фракционирование биохимические методы часто были использованы для обогатить моющих средств нерастворимые фракция от гомогенатах мозга посмертных. 6 , 12 , 13 , 14 один из наиболее распространенных методов предполагает последовательное извлечение гомогенатах ткани с буферами и моющих средств увеличения жесткости, а затем ultracentrifugation для разделения фракций растворимых и нерастворимых. Часто используемых последовательных фракционирование протокола6,14 включает гомогенизацию образцов замороженные ткани в буфере моющее средство бесплатно низкой концентрацией соли (LS) и затем результирующая нерастворимых гранулы последовательно извлекаются с буферы содержащие высокий соль, неионогенные моющих средств, высоким сахарозы, ионные моющих средств и, наконец, chaotropes как мочевины. 6 , 14 очевидный недостаток такого последовательного фракционирование протоколов является значительное количество времени и труда обязательства, необходимые для их завершения. Включая гомогенизации и ultracentrifugation, типичный пятиступенчатый фракционирование протокол может занять несколько часов или даже дней для завершения. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 , Кроме того, как много патологического белка агрегатов остаются нерастворимых в всех исклучая суровых условий19,20 большинство созданных фракций имеют ограниченную ценность. Таким образом менее строгие фракционирование шаги, используя высокие концентрации соли и неионных моющих средств являются значительной степени излишним.

Предыдущие исследования показали, что ионные моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) является отличным кандидатом для упрощенной одноступенчатых стиральный порошок фракционирование протокола. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 как денатурируя моющего средства sarkosyl является достаточно строгим, чтобы солюбилизировать последнего подавляющее большинство изначально сложенном белков в мозге без растворяющие смятых протеинов агрегатов состоит из бета амилоида (значения),6,11 фосфорилированных Тау (pTau),6 TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43),14 альфа synuclein,12,13 почесуха,23 или U1 малых ядерных ribonucleoproteins (U1 snRNPs) например U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Как sarkosyl является менее строгим, чем вездесущие анионные стиральный порошок натрия лаурилсульфат (SDS), она сохраняет менее надежные олигомерных формы агрегатов смятых протеинов, которые не могут выдержать SDS лечения. 9

Ранее мы описали сокращенное моющих средств фракционирование протокол, который достигнутые результаты, сопоставимые с более трудоемкий последовательных фракционирование методологий. 5 , опустив менее жесткие шаги фракционирования, мы смогли разработать протокол снисходительный одноступенчатых фракционирование для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от посмертных человеческого мозга. 5 этот подробный протокол, описанные здесь хорошо подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и массы на основе спектрометрии протеомики к сворачиванию функциональных белков и агрегации посева assays. 5 , 6 , 21

протокол

этика заявление: все ткани мозга были получены от Emory Alzheimer ' s болезни исследовательский центр (АЦСБ) мозга банк. Посмертный тканях человека были приобретены по протоколам надлежащего институционального обзора Совет (IRB).

1. гомогенизации и фракционирование

  1. ткани выбор
    Примечание: замороженные ткани посмертных лобной коры от здорового управления (Ctl) и патологически подтвержденных случаев AD были отобраны из Эмори АЦСБ мозга банк (n = 2). Посмертные патологического оценки распределения амилоида доска была выполнена согласно консорциуму по созданию реестра для болезни Альцгеймера ' s болезни полуколичественного забил 24 критерии, хотя в соответствии с промежуточной системы Браак оценивали нейрофибриллярных клубок патологии. 16
    1. получить замороженные посмертных мозговой ткани от здорового управления (Ctl) и патологически подтвержденных случаях AD. Использование контейнеров сухого льда, щипцы и лезвие бритвы, акцизный ~ 250 мг части серого вещества от каждого образца ткани на тарированного одноразовые весят лодки, заботясь, чтобы предотвратить ткани от таяния. Запишите вес каждый кусок, чтобы быть гомогенизированный.
    2. Акцизных ~ 250 мг серого вещества, с помощью щипцов и бритвы проверив визуально найти взаимосвязь между внешней серого вещества и внутренний белого вещества. Избегайте белого вещества и что более важно, любой крупных кровеносных сосудов или кровавый регионов, мозговые оболочки или паутинной. Держите ткани, заморожен во время процесса резки, работает быстро и часто поместив весом лодка с ткани мозга в полистирола контейнеров с сухим ice.
    3. Запись точный вес иссечена от каждого замороженный кусок, используя аналитический баланс серого вещества. Рассчитать объем буфера (LS) с низкой концентрацией соли (см. таблицу 1) необходимые для гомогенизации dounce (5 мл/г или 20% w/v).
    4. Подготовка 10 мл LS буфер с 1 x ингибитор протеазы и фосфатазы коктейль и холод на ДВС.
    5. Удалить весил ткани и весом лодка из сухого льда и кости на примерно 2 x 2 мм куски, как он тает. Передача в 2-мл пробирку гомогенизатор предварительно охлажденные dounce на льду
    6. Добавить 5 мл/г (20% w/v) буфера ледяной с низкой концентрацией соли (LS) с 1 X коктейль АБС битор протеазы и фосфатазы.
    7. Homogenize ткани мозга на льду, используя примерно 10 ударов высокой Распродажа пестик и 15 ударов низкой Распродажа пестика б.
    8. Передачи всех огневки до 2 мл полипропиленовые трубы, с помощью стеклянной пипетки Пастера. Этикетке трубки с “ й ” (общая огневки), ткани дело номер и огневки тома. Алиготе 0,8 мл в меткой 1,5 мл трубку. Любой избыток огневки может быть аналогично aliquoted и хранятся в -80 ° C.
    9. Для каждого 0,8 мл аликвота, добавьте 100 мкл 5 М NaCl и 10% (w/v) sarkosyl в концентрации 0,5 М и 1% w/v, соответственно. Mix трубы хорошо инверсии и инкубировать на льду 15 мин метки трубы с " TH-S " (общая огневки-Sarkosyl) для обозначения, что гомогенатах находятся в sarkosyl буфера (Таблица 1).
    10. Sonicate каждая трубка для трех 5 s импульсов на 30% амплитуды на льду (максимальная интенсивность = 40%) с помощью зонда microtip.
    11. определить концентрацию белка гомогенатах, используя bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного 25 метод.
      Примечание: Средняя белка концентрацию гомогенатах TH-S, подготовленных в 5 мл LS в грамм ткани — 15-20 мг/мл. Может быть фракционированный немедленно или температуре-80 ° C до использования гомогенатах.
    12. Развести TH-S гомогенатах до 10 мг/мл, с 1 x ингибиторы протеазы и фосфатазы ледяной Сарк буфера (Таблица 1).
    13. Передачи 5 мг белка (0,5 мл) каждого TH-S огневки в 500 мкл поликарбоната ультрацентрифуга трубы и пара баланс с Сарк буфера. Загрузить трубы в предварительно охлажденные ротора и ультрацентрифугирования на 180 000 x г за 30 мин при 4 ° C. передачи sarkosyl растворимые supernatants (S1) для 1.5 мл пробирок и хранить на -80 ° C.
      Примечание: (Необязательно мыть) добавить 200 мкл Сарк-буфера ультрацентрифуга трубок, содержащих моющих средств нерастворимые дроби (P1) и выбить окатышей (P1) от нижней части ультрацентрифуга трубок с помощью кончика пипетки 200 мкл.
    14. Кратко пульс спин перевернутое трубы для 2-3 s (≤ 2500 x g) на microcentrifuge передать окатышей (P1) и буфер для 1.5 мл пробирок ниже. Ресуспензируйте нерастворимых окатышей (P1) в буфере Сарк, закупорить вверх и вниз, чтобы гранулы нарушается.
    15. Пара баланс и центрифуги на 180 000 x g для дополнительных 30 мин при 4 ° C.
    16. Отменить необязательные мыть супернатант (S2) и проинкубируйте sarkosyl нерастворимые окатышей (P2) в 50-75 мкл буфера мочевины (Таблица 1) с 1 x ПОС (протеазы и фосфатазы ингибитор коктейль) за 30 мин при комнатной температуре чтобы солюбилизировать последнего Пелле.
      Примечание: Теплый мочевины буфер к комнатной температуре перед использованием, чтобы избежать осадки SDS. Для приложений, чувствительных моющего средства, опустить SDS из буфера мочевины и рассмотреть мытье нерастворимых Пелле (P2) в низкой соли буфера перед resuspending в буфере мочевины.
    17. Передачи ресуспензированы гранулы (P2) до 0,5 мл пробирок и использовать краткий (1 s) microtip sonication на 20% амплитуды (максимальная интенсивность = 40%) чтобы полностью солюбилизировать последнего гранулы.
    18. Определяют концентрацию белка sarkosyl растворимые (S1) и - нерастворимые фракций (P2), с использованием BCA пробирного метод. Использовать эти фракции сразу или хранить при температуре-80 ° C до использования.

2. Immunoblotting

  1. , Западный blotting
    Примечание: Западный blotting была выполнена согласно сообщалось ранее процедуры с незначительными изменениями. 5 , 10
    1. подготовить 40 мкг образцы всего гомогенатах (TH-S), Сарк растворимые (S1) и Сарк нерастворимые (P2) фракций в 1 X Лэмли SDS-page буфере выборки с 5 мм TCEP pH 7. Проинкубируйте образцы на 95 ° C за 5 мин
      2. Образцы
    2. нагрузки на сборный 4-12% 10-Ну бис-трис SDS-PAGE гель. Electrophorese 80 V первый сантиметр (10 мин) и 120 V на оставшуюся (60 мин) или до тех пор, пока краска отслеживания достигает нижней части геля.
    3. Использовать свежий лезвие бритвы и гель нож Сплит-открыть кассетный сборного гель. Аккуратно отрезать Расчески и самой нижней части гель с лезвием бритвы свежий.
    4. Ресуспензируйте нерастворимых окатышей (P1) в 200 мкл Сарк буфер с 1 x ПОС, закупорить вверх и вниз.
    5. Передачи на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм, с помощью метода сухой передачи на blotting машине (см. таблицу материалы).
    6. Блокирует мембраны в блокирующем буфере (BB) без анимации 20 30 мин, затем с BB с 0,05% Tween-20 (BB/T) за 30 мин. После блокирования, Промойте мембрану в TBS/T (0,1% анимации 20) на 5 минут, чтобы удалить избыток блокирующий буфер.
    7. Подготовка 1:1,000 разведений первичных антител pT231, Тау-2 (Пан Тау), AT8 и ЕЕА1 в BB/T (анимации 20 0,05%).
    8. Инкубации мембран в раствор первичных антител на ночь при 4 ° C с круговой агитации. Промойте мембрану в TBS/T для 3 x 15 мин
    9. Зонд мембраны с топографической разрежения дневно меченых вблизи IR вторичные антитела в BB/T 60 мин при комнатной температуре в темноте на шейкер. Промойте мембрану 3 x 10 мин в TBS/T и 2 x 5 мин в TBS.
    10. Проверять мембрану с помощью инфракрасной системы на длине волны возбуждения соответствующую (например 700 Нм (красный канал) для инфракрасного краситель 680 коза анти мыши IgG (H + L) среднего и 800 Нм (зеленый канал) для инфракрасного краситель 790 осла анти кролик IgG (H + L вторичные)).
    11. Использование изображений программное обеспечение для количественного определения интенсивности сигнала и выполнять замеры денситометрия согласно производителя ' s инструкции, обеспечение auto фоновый параметр равным средний весь фон.

Результаты

Сокращенная сингл шаг sarkosyl фракционирование протокол был использован для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от контроля и AD посмертных мозга (рис. 1). Белки из й-S, S1, S2 и P2 фракций были решены путем SDS-PAGE, фиксированный за 15 мин в К?...

Обсуждение

Здесь мы представляем и обсудить сокращенное одноступенчатых моющих средств фракционирование протокол, который применяется для широкого ряда экспериментальных приложений, начиная от массы на основе спектрометрии протеомики анализа функциональных белков сворачиванию анализов и За?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Drs. Джим Lah и Аллан Levey, Эмори Кафедра неврологии, за полезные замечания и предложения. Эта работа частично финансируется путем ускорения медицины партнерство гранта (U01AG046161-02), Emory Альцгеймера болезнь научно-исследовательский центр (P50AG025688) и Национальный институт по проблемам старения предоставить (R01AG053960-01) N.T.S. Это исследование было также поддержано в невропатологии ядро Эмори неврологии NINDS основной зал Грант, P30NS055077.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)Thermo Fisher78441protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)Fisher ScientificFB505110microtip ultrasonicator
Optimax TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361545refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotorBeckman Coulter362224ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwallBeckman Coulter343776ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample bufferHome-madeN/ASDS-PAGE
TCEP solution, neutral pHThermo Fisher77720reducing agent
(TBS) blocking bufferThermo Fisher37542blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20Thermo Fisher37543blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-wellThermo FisherNW04120BOXprecast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)Sigma AldrichL5777-50Gdetergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibodyChemiconMAB375antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibodyMilliporeMAB5450antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)Thermo FisherMN1020antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibodyabcamab2900antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA21058antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA11374antibodies
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, miniThermo FisherIB23002Gel transfer

Ссылки

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
  23. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128proteostasisproteinopathysarkosyl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены