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要約

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。

要約

本研究ではヒトの死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮のため短縮されたシングル ステップ分別プロトコルについて述べる.イオン洗剤 N ラウリルサルコシン (sarkosyl) は効果的に脳組織の変性 proteinopathies の広い範囲から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮を許可するようにネイティブで折られた蛋白質を可溶性します。アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病。人間の制御と広告死後脳組織病理学的リン酸化タウ、原線維変化のコア コンポーネントを含む洗剤不溶性タンパク質凝集体を豊かにする sarkosyl の存在下で超遠心法による均質化と堆積をいた広告のもつれ。集約されたリン酸化タウと洗剤水溶性タンパク質、初期エンドソーム抗原 1 (EEA1) コントロール、AD 脳での差分の溶解性を示した西部にしみが付くこと。プロテオーム解析も明らかに豊かなβ-アミロイド (a β)、タウ、snRNP70 (U1-70 K)、およびコントロール、前組織分別戦略と一貫性のあるのに比べて AD 脳の sarkosyl 不溶性画分におけるアポリポ蛋白 E (アポ).したがって、この単純な濃縮プロトコルは質量分析を用いたプロテオミクス共同凝集アッセイ西部にしみが付くこと機能性タンパク質からまで実験用アプリケーションの広い範囲に最適です。

概要

アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、密接に関連のプリオン病などの神経変性疾患はの漸進的な蓄積によって特徴付けられる proteinopathies脳内認知を伴う洗剤不溶性タンパク質凝集体を辞退します。1,2この共有の病理学的特徴は、病因とこれらの神経変性疾患の病態の中心的な役割を果たすと考えられています。2これらの凝集体は通常繰り返し誤って折りたたまれたタンパク質がβクロス展示の単位から成る高分子アミロイド線維の構成-構造。1,2,3,4生化学的、アミロイド凝集体は耐化学または熱変性と溶解、分析、浄化に特有の課題3と、従来の生化学的な手法で研究します。2,5,6,7,8,9,10,11当然、洗剤不溶性タンパク質画分されている誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を伴う神経変性疾患の病態生理に多くの研究の焦点。6,12,13,14

生化学的な分別の技術は、死後脳乳剤から洗剤不溶性分画を豊かにするためしばしば利用されています。6,12,13,14最も一般的な方法の 1 つを含むバッファーを持つ組織ホモジネートの連続抽出と水溶性と不溶性画分を分割する遠心続いて逼迫化洗剤。一般的に使用されるシーケンシャル分別プロトコル6,14を含む洗剤を用いない低塩 (LS) バッファーの凍結するティッシュ サンプルの均質化と結果不溶性のペレットが順番に抽出した、高い塩、非イオン性洗剤、高蔗糖を含むバッファー、界面活性剤そして chaotropes 尿素のような。6,14このような連続した分別のプロトコルの明らかな欠点はかなりの時間とそれらを完了するために必要な労働のコミットメントです。均質化と超遠心法を含む典型的な 5 つのステップ分別プロトコル取ることができるいくつか時間、あるいは日で完了します。4,6,7,10,15,16,17,18また、として多くの病理学的タンパク質凝集体残る過酷な条件19,20を除いてすべての不溶性生成された分数のほとんどは、限られた価値。したがって、高い塩の集中および非イオン性洗剤を利用したより少なく厳しい分別手順は主に冗長です。

以前の研究では、イオン洗剤 N ラウリルサルコシン (sarkosyl) が簡易のシングル ステップ洗剤分別のプロトコルのための優秀な候補者であることを示しています。5,6,12,13,14,21,22,23変化洗剤として sarkosyl は β-アミロイド (a β)6,11 から成る誤って折りたたまれたタンパク質凝集体を可なし脳内ネイティブ折られた蛋白質の大半を可溶化に十分に厳格リン酸化タウ (pTau)、6タール DNA 結合蛋白質 43 (TDP-43)、14 α-シヌクレイン、12,13スクレイピー、23または U1 小さなに原子力 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) U1-70 K など。5,21,22Sarkosyl ユビキタス陰イオン洗剤ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) よりより少なく厳しいが、SDS の処置に耐えることはできません誤って折りたたまれたタンパク質の凝集体の堅牢性の低いオリゴマー フォームを保存します。9

以前より面倒の順次分別方法論に匹敵する結果を達成する省略形の洗剤-分別のプロトコルについて述べる。5以下の厳しい分別手順を省略するが死後の人間の脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮の安易なシングル ステップ分別のプロトコルを開発することができました。5記載この詳細なプロトコルは西部にしみが付くことから、さまざまな実験的用途の広い範囲のために適して、プロテオミクスの質量分析を用いた機能性タンパク質の折りたたみと集計のシードを試金します。5,6,21

プロトコル

倫理の声明: すべての脳組織がエモリー アルツハイマーから得られた ' s 病研究センター (ADRC) ブレイン バンク。人間の死後の組織は適切な制度審査委員会 (IRB) プロトコルの下で買収された

。

1 均質化と分別

  1. 組織選択
    注: AD 症例は、エモリーから選ばれた健康管理 (Ctl) からと思われる死後の前頭皮質組織を凍結。アジア防災センター ブレイン バンク (n = 2)。アルツハイマー病のためレジストリを確立するコンソーシアムによるとアミロイド斑の分布の事後神経病理学的評価を行った ' 病半定量が基準 24 を得点神経昆布病理学は、ブラークのステージング システムに従って評価されました。 16
    1. 取得健康管理 (Ctl) から病理組織学的の死後脳組織の凍結は、広告の場合を確認しました。ドライアイス、鉗子、かみそりの刃の容器を利用して、消費税 〜 250 mg tared 使い捨ての各組織サンプルから灰白質部ボート、組織が融解するを防ぐために世話の重量を量る。均質にする各お荷物の重量を記録します
      2. 。
    2. 消費税 〜 目視で鉗子やかみそりを使用して外側の灰白質と内部の白質間のインタ フェースを検索する灰白質の 250 mg。白質ともっと重要なは、いずれかを避けるため大きな血管や血地域、髄膜、またはくも膜。迅速に作業し、よく乾燥氷のポリスチレン容器に脳組織と計量ボートを置くことによって切削過程における凍結組織を維持
    3. は、分析用天秤を使用して各固定部分から摘出した灰白質の正確な重量を記録します。低ソルト (LS) バッファーのボリュームを計算する dounce 均質化 (5 mL/g または 20% の w/v) のために必要 (表 1 を参照).
    4. 準備 10 mL LS バッファー プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテルや氷に興じ x 1
    5. は、雪解けの季節からドライアイスと約 2 × 2 mm の部分にサイコロの重量を量られた組織と計量ボートを削除します。氷上 2 mL 中古冷蔵 dounce ホモジナイザー チューブへの転送
    6. 5 mL/g (20 %w/v) ホスファターゼとプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 と冷たい低塩 (LS) バッファーを追加します
      7. 。
    7. Homogenize 脳組織の高クリアランス杵と杵低クリアランス B. 15 ストロークの約 10 ストロークを使って氷の上
    8. は、すべての磨砕液をガラス パスツール ピペット 2 mL ポリプロピレン チューブに転送します。ラベルを持つ管 “ TH ” (総磨砕液)、ティッシュ ラベル付き 1.5 mL チューブに番号、およびホモジネート ボリューム。 因数 0.8 mL の場合。避けようと-80 に格納されて任意の過剰の磨砕液を同様にすることができます ° C
    9. 各 0.8 mL を分注、追加 100 μ L 各 5 M の塩化ナトリウムの 10% (w/v) sarkosyl 濃度の 0.5 M と 1 %w/v、それぞれ。逆転でよく管を混ぜるし、15 分ラベル チューブを氷中でインキュベート " TH S " (総磨砕液-Sarkosyl)、乳剤は、sarkosyl バッファー (表 1) を示す
      10. 。
    10. 氷の上の 30% の振幅で 3 つ 5 のパルスの各チューブを超音波 (最大強度 = 40%) を使用して各プローブ
    11. ビシンコニン酸 (BCA) を使用して磨砕液のタンパク質濃度測定 25 決定。メソッド
      。 注: 組織の 1 グラムあたり 5 mL LS で作製した TH S 乳剤の平均蛋白質の集中は 15-20 mg/mL です。ホモジネートをすぐに分別や使用まで-80 ° C で保存することができます
      12. 。
    12. を 10 mg/mL の冷たいサーク バッファー (表 1) を用いたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 × 1 回-S の希釈乳剤
      13. 。 500 μ L ポリカーボネート遠心管にサーク バッファーとのペア バランス各 TH S ホモジネートの
    13. 転送 5 mg タンパク質 (0.5 mL)。中古冷蔵ローターと 1.5 mL チューブに 4 ° C sarkosyl 可溶性転送清 (S1) で 30 分間 180,000 × g で遠心管に読み込むし、-80 デパート ° C
      注: (任意選択洗浄) 追加 200 μ L、遠心するサーク バッファーの管洗剤不溶性画分 (P1) を含む、200 μ L ピペット チップを用いた遠心管の底からペレット (P1) を外します
      14. 。 2-3 s 用
    14. 簡単にパルス スピン逆管 (≤ 2,500 x g) 以下 1.5 mL チューブにペレット (P1) とバッファー転送する遠心機に。ペレットは中断するように、上下にピペッティングでサーク バッファーで (P1) の不溶性のペレットを再懸濁します
      15. 。
    15. ペア バランスと 4 でさらに 30 分間 180,000 × g で遠心する ° C
    16. (S2) の任意選択洗浄滅菌蒸留水し、1 sarkosyl 不溶性のペレット (P2) 尿素バッファー (表 1) の 50-75 μ L を孵化させなさい室温で 30 分間の可溶化、(プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル) PIC x、ペレット
      。 SDS 析出を避けるため使用する前に室温に注意: 暖かい尿素バッファー。洗剤に敏感なアプリケーションの尿素バッファーから SDS を省略し、尿素バッファーに再する前に低い塩バッファーで不溶性のペレット (P2) の洗浄を検討します
      17. 。
    17. 0.5 mL チューブに再懸濁のペレット (P2) を転送し、簡単な使用 (1 s) 20% 振幅で陰極超音波 (最大強度 = 40%) 完全にペレットの可溶化
      18. 。
    18. Sarkosyl 可溶性 (S1) のタンパク質濃度を決定する・ BCA を使用して不溶性 (P2) 分画測定法。すぐにこれらの分数を使用または使用するまで-80 ° C で保存します
      19. 。

2。免疫ブロット

    西部にしみが付くこと

  1. 注: わずかな修正と以前に報告された手順に従って行われた西部にしみが付くこと 。5 , 10
    1. 合計乳剤 (TH 秒)、サーク可溶性 (S1) と 5 mM TCEP pH 7 で 1 X 塩化物イオン sds-page サンプルバッファーでサーク不溶性 (P2) 分数の準備 40 μ g のサンプル。95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベート
    2. ロード サンプル プレキャスト 10 ウェル 4-12% ビス トリス SDS-PAGE のゲルします。80 最初センチメートル (10 分) のための V、120 V (60 分) 残りの部分または追跡色素がゲルの底まで electrophorese.
    3. は、開いている分割既製ゲル カセットに新鮮なかみそりの刃とゲル ナイフを使用します。櫛と新鮮なかみそりの刃とゲルの一番下を優しく切り取る
      4. 。
    4. 1 x ピペッティングの写真上下で 200 μ l サーク バッファーで (P1) の不溶性のペレットを再懸濁します
      5. 。
    5. あぶらとりマシン上乾燥の転送方法を使用して 0.2 μ m 硝酸セルロースの膜への転送 (材料表を参照してください).
    6. ブロック BB と続いて 0.05% Tween 20、30 分間なしバッファー (BB) の妨害で膜トゥイーン 20 (BB/T) 30 分間。ブロック後、TBS/T で膜をすすいでください (0.1% Tween 20) 余分なブロック バッファーを削除する 5 分
      7. 。 一次抗体 pT231、タウ 2 (パン タウ)、AT8 の
    7. 準備縮尺希釈液BB/t EEA1 (0.05% Tween 20).
    8. では、円形撹拌で 4 ° C で一晩一次抗体溶液中膜を孵化させなさい。3 x 15 分 TBS/T の膜を洗浄
    9. は、シェーカーで暗闇の中で蛍光標識した近赤外線二次抗体 BB/T で室温で 60 分間の 1:20,000 希釈で膜をプローブします。TBS で TBS/T で、2 × 5 分の 3 × 10 分の膜を洗浄
    10. スキャン イメージング システム (例えば 700 nm (赤のチャネル) 赤外光吸収色素 680 ヤギ抗マウス IgG (H + L) セカンダリと 800 nm (グリーン チャンネル) 赤外光吸収色素 790 ロバ抗うさぎ IgG (H + L のための適切な励起波長の赤外線を用いた膜) セカンダリ).
    11. イメージング ソフトウェアを使用して信号強度を定量化し、メーカーごとのデンシトメトリーによる計測を実行 ' の指示、自動-背景の設定を確保する背景全体を平均に設定されます
      12. 。

結果

省略されたシングル ステップ sarkosyl-分別のプロトコルは、管理と広告死後脳 (図 1) から洗剤不溶性タンパク質凝集体を豊かにする使用されました。TH S、S1、S2、P2 の一部分からの蛋白質は、SDS-PAGE、Coomassie 青い固定バッファー続けて Coomassie ブリリアント ブルー G-250 染色バッファーと穏やかな染色で 15 分間固定によって解決されました。S2 画?...

ディスカッション

ここを紹介し、議論する省略形のシングル ステップ洗剤分別のプロトコルさまざまな試金の折りたたみ機能性タンパク質質量分析を用いたプロテオミクス解析に至る実験アプリケーションに適用されます。西部にしみが付くこと.5,6,7,10この方法論は、おそらく最も効果的なアルツハイマー病など...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、有用なコメントや提案を夫妻ジム Lah とアランの売れ行き、エモリー神経内科をありがちましょう。この作品もあって資金が供給された医学パートナーシップの促進助成 (U01AG046161-02)、エモリー アルツハイマー病研究センター (P50AG025688)、国立老化研究所 (R01AG053960-01) に与える N.T.S.この研究はだった一部のエモリー神経組織プラスミノーゲンアクテベータ中核施設助成金、P30NS055077 の神経病理コアでもサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)Thermo Fisher78441protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)Fisher ScientificFB505110microtip ultrasonicator
Optimax TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361545refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotorBeckman Coulter362224ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwallBeckman Coulter343776ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample bufferHome-madeN/ASDS-PAGE
TCEP solution, neutral pHThermo Fisher77720reducing agent
(TBS) blocking bufferThermo Fisher37542blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20Thermo Fisher37543blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-wellThermo FisherNW04120BOXprecast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)Sigma AldrichL5777-50Gdetergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibodyChemiconMAB375antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibodyMilliporeMAB5450antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)Thermo FisherMN1020antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibodyabcamab2900antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA21058antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA11374antibodies
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, miniThermo FisherIB23002Gel transfer

参考文献

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