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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Zusammenfassung

In dieser Studie beschreiben wir eine abgekürzte Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn. Das Ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) solubilisiert effektiv nativ gefaltete Proteine im Gehirngewebe, so dass die Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus einer breiten Palette von neurodegenerativen Proteinopathies, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose und Prion-Krankheiten. Menschlichen Kontrolle und Post-mortem Hirngewebe AD wurden homogenisiert und sedimentierte durch Ultrazentrifugation in Anwesenheit von Sarkosyl Waschmittel-unlösliche Aggregate einschließlich pathologischer phosphorylierten Tau, das Herzstück der neurofibrillären bereichern Verwicklungen in AD. Westliche Beflecken, demonstriert die differenzielle Löslichkeit der aggregierten phosphoryliert-Tau und die Waschmittel-lösliche Protein, frühen Endosom Antigen 1 (EEA1) in Steuerung und AD Gehirn. Proteomic Analysen ergaben auch Bereicherung der β-Amyloid (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 - 70 K), und Apolipoprotein E (APOE) in die Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen von AD Gehirn im Vergleich zu denen der Kontrolle, konsistent mit früheren Gewebe Fraktionierung Strategien . Somit eignet sich dieses einfache Bereicherung-Protokoll für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und funktionsfähiges Protein Co Aggregation Assays, Massenspektrometrie-basierte Proteomics.

Einleitung

Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die eng verwandten Prion-Krankheiten sind gekennzeichnet durch die allmähliche Anhäufung von proteinopathies Waschmittel-unlösliche Aggregate im Gehirn mit begleitenden kognitiven ablehnen. 1 , 2 diese gemeinsame pathologische Funktion wird gedacht, um eine zentrale Rolle in der Ätiologie und Pathophysiologie dieser neurodegenerativen Krankheiten. 2 diese Aggregate bestehen typischerweise aus Polymeren Amyloid Fasern, die zusammengesetzt sind, sich wiederholender Einheiten der fehlgefaltete Protein ausstellenden Kreuz β-Struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemisch, Amyloid Aggregate sind sehr widerstandsfähig gegen chemische oder thermische Denaturierung und Solubilisierung,3 stellt besondere Herausforderungen an ihre Reinigung, Analyse und über traditionelle biochemischen Techniken zu studieren. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 es überrascht nicht, wurde die Waschmittel-unlösliche Proteinfraktion viel Forschungsschwerpunkt in der Pathophysiologie der neurodegenerativen Erkrankungen mit der Anhäufung von fehlgefaltete Proteine. 6 , 12 , 13 , 14

Biochemische Fraktionierung Techniken wurden oft genutzt, um die Reinigungsmittel-unlösliche Fraktion aus Post-mortem Gehirn Homogenates bereichern. 6 , 12 , 13 , 14 eine der am häufigsten verwendeten Methoden beinhaltet die sequentielle Extraktion von Gewebe Homogenates mit Puffern und Reinigungsmittel erhöhen Stringenz, gefolgt von Ultrazentrifugation, die löslichen und unlöslichen Anteile zu partitionieren. Eine häufig verwendete sequentielle Fraktionierung Protokoll6,14 beinhaltet die Homogenisierung der gefrorene Gewebeproben in einem Waschmittel-freie wenig Salz (LS)-Puffer und die daraus resultierende unlösliche Pellets werden dann nacheinander mit extrahiert Puffer mit hohen Salz, nichtionischen Detergentien, hohen Saccharose, wie Ionischen Detergentien und schließlich Chaotropes Harnstoff. 6 , 14 eine offensichtliche Nachteil solch eine sequentielle Fraktionierung Protokolle ist die beträchtliche Zeit und Arbeit Engagement erforderlich, um sie abzuschließen. Einschließlich der Homogenisierung und Ultrazentrifugation, eine typische 5-stufige Fraktionierung Protokoll dauert mehrere Stunden oder sogar Tage dauern. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 darüber hinaus möglichst viele pathologische Proteinaggregaten unlöslich in allen außer den härtesten Bedingungen19,20 bleiben die meisten der erzeugten Brüche sind nur von begrenztem Wert. Somit sind die weniger strengen Fraktionierung Schritte nutzen hohe Salzkonzentrationen und nichtionische Detergentien weitgehend überflüssig.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) ein ausgezeichneter Kandidat für einen vereinfachten einstufigen Waschmittel Fraktionierung Protokoll ist. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als denaturierenden Waschmittel, Sarkosyl ist streng genug, um die überwiegende Mehrheit der nativ gefaltete Proteine im Gehirn anderweitig ohne Gefäss-fehlgefaltete Protein-Aggregate bestehend aus Beta-Amyloid (Aβ),6,11 phosphorylierten Tau (pTau),6 TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43),14 Alpha-Synuclein,12,13 Scrapie,23 oder U1 small nuclear Ribonucleoproteins (U1 SnRNPs) wie U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Da Sarkosyl weniger streng als die allgegenwärtigen anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) ist, bewahrt es weniger robuste Oligomere Formen von fehlgefaltete Protein-Aggregate, die SDS-Behandlung nicht standhalten können. 9

Zuvor beschrieben wir eine abgekürzte Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, das vergleichbar mit aufwendiger sequentielle Fraktionierung Methoden Ergebnisse erzielt. 5 durch die weniger strenge Fraktionierung Schritte auslassen, konnten wir ein facile Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn zu entwickeln. 5 dieses ausführliche Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und Massenspektrometrie-basierte Proteomics, funktionsfähiges Protein misfolding und Aggregation seeding assays. 5 , 6 , 21

Protokoll

Ethik-Erklärung: alle Hirngewebe stammen aus der Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) Brain Bank. Post-mortem Gewebe unter richtigen institutionellen Review Board (IRB) Protokolle erworben wurden.

1. Homogenisierung und Fraktionierung

  1. Gewebe Auswahl
    Hinweis: Frozen Post-mortem frontalen Kortex Gewebe aus gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch bestätigten AD-Fälle wurden ausgewählt von der Emory ADRC Gehirn Bank (n = 2). Post-Mortem neuropathologische Auswertung der Amyloid-Plaques Verteilung wurde entsprechend des Konsortiums, eine Registrierung für Alzheimer zu etablieren durchgeführt ' s Krankheit semi-quantitativen Kriterien 24, scoring, obwohl neurofibrillären Gewirr Pathologie wurde gemäß der Braak-staging-System bewertet. 16
    1. erhalten Post-mortem Hirngewebe von gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch eingefroren bestätigt AD-Fälle. Verwendung von Containern von Trockeneis, Zange und einer Rasierklinge, Verbrauchsteuern ~ 250 mg Teile der grauen Substanz aus jede Gewebeprobe auf tarierten Einweg wiegen Boote, kümmert sich um Auftauen des Gewebes zu verhindern. Nehmen Sie das Gewicht jedes Stückes, homogenisiert werden.
    2. Verbrauchsteuern ~ 250 mg der grauen Zellen mit Zange und gestochen von visuell inspizieren, um die Schnittstelle zwischen der äußeren graue Substanz und inneren weißen Substanz zu finden. Vermeiden Sie weiße Substanz und was noch wichtiger ist, alle großen Blutgefäße oder blutigen Regionen, Hirnhäute oder Arachnoidea Mater. Halten Sie das Gewebe eingefroren während des Schneidprozesses indem arbeiten schnell und häufig mit einem Gewicht von Boot mit Hirngewebe in Polystyrol-Behälter mit trocken Ice
    3. Datensatz das exakte Gewicht der grauen Substanz, die aus jedem gefrorenen Stück mit Hilfe einer Analysenwaage herausgeschnitten. Berechnen Sie das Volumen des wenig Salz (LS) Puffer für Dounce Homogenisierung (5 mL/g oder 20 % w/V) benötigt (siehe Tabelle 1).
    4. Vorbereitung 10 mL LS Puffer mit 1 x Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail und chill auf Eis.
    5. Entfernen Sie wog Gewebe und mit einem Gewicht von Boot aus Trockeneis und Würfel in etwa 2 x 2 mm Stücke wie es taut. Transfer zu einem 2 mL vorgekühlt Dounce Homogenisator Schlauch auf Ice
    6. 5 mL/g (20 % w/V) der eiskalten wenig Salz (LS) Puffer mit 1 X Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail hinzufügen.
    7. Homogenize das Hirngewebe auf Eis mit etwa 10 Schläge von hoher Bodenfreiheit Stößel A und 15 Hübe der niedrige Clearance Stößel B.
    8. Alle Homogenat auf ein 2 mL Polypropylen-Rohr mit einem Glas Pasteurpipette übertragen. Beschriften der Röhrchen mit “ TH ” (insgesamt Homogenat), das Gewebe Fall Nummer und homogenisierte Volumen. aliquoten 0,8 mL in einem beschrifteten 1,5 mL-Tube. Jede überschüssige Homogenat kann ähnlich sein, regelmÄÑig und gespeicherte bei-80 ° c
    9. Zu je 0,8 mL Aliquoten, bzw. 100 µL 5 M NaCl und 10 % (w/V) Sarkosyl zu Konzentrationen von 0,5 M und 1 % w/V, hinzufügen. Mischen Sie Rohre gut durch Umkehrung und inkubieren Sie auf Eis für 15 min. Label Rohre mit " TH-S " (insgesamt Homogenat-Sarkosyl) darauf hin, dass die Homogenates in Sarkosyl-Puffer (Tabelle 1).
    10. Beschallen jedes Rohr für drei 5 s-Pulse bei 30 % Amplitude auf Eis (maximale Intensität = 40 %) mit einer Sonde Microtip.
    11. bestimmen die Proteinkonzentrationen von der Homogenates mit der Bicinchoninic Säure (BCA) assay 25 Methode.
      Hinweis: Die durchschnittliche Proteinkonzentration von TH-S Homogenates in 5 mL LS pro Gramm Gewebe vorbereitet ist 15-20 mg/mL. Die Homogenates fraktioniert sofort oder bis zur Verwendung bei-80 ° C gelagert werden kann.
    12. Verdünnen TH-S Homogenates bis 10 mg/mL mit eiskalten Sark Puffer (Tabelle 1) mit 1 x Phosphatase, Protease-Inhibitoren.
    13. Transfer 5 mg Protein (0,5 mL) von jeder TH-S Homogenat in 500 µL Polycarbonat Ultrazentrifugen Tuben und paar-Balance mit Sark-Puffer. Laden Sie Rohre in einem vorgekühlt Rotor und Ultrazentrifugen 180.000 x g für 30 min bei 4 ° c Übertragung Sarkosyl lösliche Überstände (S1) auf 1,5 mL Röhrchen und Lagern bei-80 ° c
      Hinweis: (Optional-Waschanlagen) fügen Sie 200 µL Sark-Puffer, der Ultrazentrifuge Rohre mit Waschmittel-unlösliche Fraktionen (P1) und verdrängen die Pellets (P1) von der Unterseite der Ultrazentrifuge Rohre mit einer Pipettenspitze 200 µL.
    14. Kurz Puls-Spin die invertierten Rohre für 2-3 s (≤ 2.500 X g) auf einem Microcentrifuge der Pellets (P1) und Puffer auf die 1,5 mL Röhrchen unten übertragen. Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) im Sark-Puffer durch Pipettieren rauf und runter um sicherzustellen das Pellet wird gestört,.
    15. Paar-Balance und Zentrifuge bei 180.000 x g für eine zusätzliche 30 min bei 4 ° c
    16. Verwerfen den optionalen waschen überstand (S2) und inkubieren Sie die Sarkosyl-unlösliche Pellets (P2) in 50-75 µL Harnstoff Puffer (Tabelle 1) mit 1 x PIC (Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail) für 30 min bei Raumtemperatur zu solubilisieren die Pellet.
      Hinweis: Warme Harnstoff Puffer auf Raumtemperatur vor Gebrauch SDS Niederschlag zu vermeiden. Für Waschmittel-Sensitive Anwendungen weglassen SDS aus Harnstoff Puffer und in niedrigen Salz Puffer betrachten waschen das unlösliche Pellet (P2), bevor in Harnstoff Puffer resuspending.
    17. Übertragen die resuspendierte Pellets (P2) auf 0,5 mL Röhrchen und verwenden Sie kurze (1 s) Microtip Beschallung bei 20 % Amplitude (maximale Intensität = 40 %), voll die Pellets solubilisieren.
    18. Bestimmen die Proteinkonzentrationen von Sarkosyl löslich (S1) und unlösliche (P2) Brüche mit der BCA assay Methode. Diese Fraktionen sofort verwenden oder bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

2. Immunoblotting

  1. Western Blot
    Hinweis: Western blotting nach zuvor gemeldeten Verfahren mit leichten Modifikationen durchgeführt wurde. 5 , 10
    1. bereiten 40 µg Proben von insgesamt Homogenates (TH-S), Sark-löslich (S1) und Sark-unlösliche (P2) Brüche in 1 X Laemmli SDS-Page-Probenpuffer mit 5 mM DÄMMUND pH 7. Inkubieren Sie Proben bei 95 ° C für 5 min.
    2. Last Proben auf ein Fertigteil 10-Brunnen 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE gel. Bei 80 V für die ersten Zentimeter (10 min) und 120 V für den Rest (60 min) oder bis die Tracking-Farbstoff den Boden des Gels erreicht electrophorese.
    3. Verwenden Sie frischen Rasierklinge und Gel Messer auf Split-die vorgegossenen Gel-Kassette offen. Sanft die Kämme und ganz unten das Gel mit einer frischen Rasierklinge wegschneiden.
    4. Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) in 200 µl Sark-Puffer mit 1 X PIC durch Pipettieren rauf und runter.
    5. Übertragung an eine 0,2 µm Nitrozellulose-Membran mit einer trockenen Übertragungsmethode auf ein Blot Maschine (siehe der Materialtabelle).
    6. Blockieren die Membran in blockierende Puffer (BB) ohne Tween 20 für 30 min, gefolgt mit BB mit 0,05 % Tween 20 (BB/T) für 30 min. Nach der Blockierung, spülen Sie die Membran in TBS/T (0,1 % Tween 20) für 5 min um überschüssige blockierende Puffer entfernen.
    7. Bereiten 1:1,000 Verdünnungen der primären Antikörper pT231, Tau-2 (Pan Tau), AT8 und EEA1 in BB/T (0,05 % Tween 20).
    8. Brüten die Membranen in Primärantikörper Lösung über Nacht bei 4 ° C mit kreisförmigen Bewegung. Spülen Sie die Membran in TBS/T für 3 x 15 min.
    9. Sonde die Membran mit einer Verdünnung 1: 20.000 Eindringmittel beschriftet in der Nähe von IR Sekundärantikörper in BB/T für 60 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit auf Shaker. Spülen Sie die Membran für 3 x 10 min in TBS/T und 2 x 5 min in El
    10. Scannen die Membran, die über eine Infrarot imaging-System bei der entsprechenden Erregung Wellenlänge (z.B. 700 nm (Rot-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 680 Ziege Anti-Maus IgG (H + L) sekundär- und 800 nm (Grün-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 790 Esel Anti-Kaninchen IgG (H + L (sekundäre)).
    11. Verwenden die Software zur Abbilderstellung Signalintensitäten zu quantifizieren und Densitometrie Messungen gemäß den Hersteller ' Anweisungen, Auto-Hintergrund zu gewährleisten wird voraussichtlich den gesamten Hintergrund durchschnittliche.

Ergebnisse

Das abgekürzte einstufigen Sarkosyl-Fraktionierung-Protokoll wurde verwendet, um Waschmittel-unlösliche Aggregate aus Kontrolle und AD Post-mortem Gehirn (Abbildung 1) zu bereichern. Proteine aus TH-S, S1, S2 und P2 Fraktionen wurden gelöst durch SDS-PAGE, für 15 min in Coomassie Blau Fixativ Puffer gefolgt von schonende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer fest. Die Wiederfreisetzung Schritt ist optional, da gab es nicht nachweisba...

Diskussion

Hier wir vorstellen und diskutieren eine abgekürzte Einzelschritt Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, die für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen von Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen bis hin zu funktionellen Protein misfolding assays und westliche Beflecken. 5 , 6 , 7 , 10 dieser Methodik ist vielleicht die meisten wirksam, wenn Sie zur Untersuchung neurodegenerati...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Jim Lah und Allan Levey, Emory Universitätsklinik für Neurologie, für die hilfreichen Kommentare und Anregungen. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch die Beschleunigung der Medizin Partnerschaft Grant (U01AG046161-02), die Emory Alzheimer Disease Research Center (P50AG025688) und eine National Institute on Aging gewähren (R01AG053960-01) N.T.S. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die Neuropathologie Kern von Emory Neurowissenschaften NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)Thermo Fisher78441protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)Fisher ScientificFB505110microtip ultrasonicator
Optimax TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361545refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotorBeckman Coulter362224ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwallBeckman Coulter343776ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample bufferHome-madeN/ASDS-PAGE
TCEP solution, neutral pHThermo Fisher77720reducing agent
(TBS) blocking bufferThermo Fisher37542blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20Thermo Fisher37543blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-wellThermo FisherNW04120BOXprecast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)Sigma AldrichL5777-50Gdetergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibodyChemiconMAB375antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibodyMilliporeMAB5450antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)Thermo FisherMN1020antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibodyabcamab2900antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA21058antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA11374antibodies
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, miniThermo FisherIB23002Gel transfer

Referenzen

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