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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole de fractionnement abrégée pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain est décrite.

Résumé

Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole abrégée seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain de post-mortem. Le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilise efficacement les protéines nativement repliées dans le tissu cérébral, ce qui permet l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent parmi un large éventail de proteinopathies neurodégénératives, telles que La maladie d’Alzheimer (ma), la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique et maladies à prions. Contrôle de l’homme et les tissus du cerveau post-mortem AD ont été homogénéisés et sédimentée par ultracentrifugation en présence de sarkosyl pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent dont la protéine tau phosphorylée pathologique, le composant principal d’enchevêtrements enchevêtrements dans AD. Western blot ont démontré la solubilité différentielle des agrégés-tau phosphorylée et la protéine soluble dans un détergent, Endosome précoce Antigen 1 (EEA1) dans le contrôle et le cerveau. Analyse protéomique a également révélé l’enrichissement des β-amyloïde (Aß), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) et de l’apolipoprotéine E (APOE) dans les fractions sarkosyl insoluble du cerveau par rapport à celles du contrôle, compatible avec les stratégies précédentes de fractionnement tissulaire . Par conséquent, ce protocole simple enrichissement est idéal pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et protéine fonctionnelle épreuves agrégation Co à basé sur la spectrométrie de masse protéomique.

Introduction

Les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH), sclérose latérale amyotrophique (SLA) et les maladies de prion étroitement apparentées sont proteinopathies caractérisée par l’accumulation progressive de agrégats de protéine insoluble dans le détergent dans le cerveau avec accompagnement cognitives déclinent. 1 , 2 cette caractéristique pathologique partagée est censée jouer un rôle central dans l’étiologie et la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives. 2 ces agrégats sont composés de polymères fibres amyloïdes, qui sont composées d’unités de protéines mal repliées montrant Croix βrépétitives-structure. 1 , 2 , 3 , 4 biochimiquement, agrégats amyloïdes sont très résistants à la dénaturation chimique ou thermique et solubilisation,3 qui présente des difficultés particulières pour leur purification, analyse et étudient via des techniques biochimiques classiques. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 sans surprise, la fraction des protéines insolubles dans un détergent a fait l’objet de nombreuses recherches dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives impliquant l’accumulation de protéines mal repliées. 6 , 12 , 13 , 14

Les techniques de fractionnement biochimique ont souvent été utilisés pour enrichir la fraction insoluble dans le détergent d’homogénats de cerveau post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 une des méthodes plus courantes consiste à l’extraction séquentielle des homogénats de tissus avec des tampons et des détergents d’accroître la rigueur, suivi par ultracentrifugation pour partitionner les fractions solubles et insolubles. Un fractionnement séquentiel couramment utilisés protocole6,14 implique l’homogénéisation des échantillons de tissus congelés dans un tampon sans tensioactifs hyposodé (LS) et les pellets insolubles qui en résultent sont extraites puis séquentiellement avec tampons contenant du sel élevé, détergents non ioniques, saccharose élevé, détergents ioniques et enfin chaotropes comme urée. 6 , 14 un inconvénient évident de ces protocoles de fractionnement séquentiel un est beaucoup de temps et engagement de travail nécessaire pour les terminer. Y compris l’homogénéisation et l’ultracentrifugation, un protocole typique cinq étapes fractionnement peut prendre plusieurs heures, voire jours pour compléter. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 en outre, agrégats de protéine pathologique autant restent insolubles dans tous, mais les plus dures conditions19,20 la plupart des fractions générées sont d’une utilité limitée. Ainsi, les mesures moins rigoureuses fractionnement utilisant de fortes concentrations en sel et détergents non ioniques sont largement redondants.

Des études antérieures ont montré que le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) est un excellent candidat pour un protocole simplifié seule étape détergent fractionnement. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 comme un détergent dénaturation, sarkosyl est suffisamment strict pour solubiliser la grande majorité des protéines nativement repliées dans le cerveau sans la solubilisation des agrégats de protéines mal repliées composés de protéine bêta-amyloïde (Aß),6,11 tau phosphorylée (pTau),6 protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43),14 alpha-synucléine, tremblante de12,13 ,23 ou U1 petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP U1) tels que U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl étant moins rigoureux que le dodécylsulfate de sodium de détergent anionique omniprésent (SDS), elle conserve moins robustes formes oligomères d’agrégats de protéines mal repliées qui ne peut pas résister aux traitement de SDS. 9

Auparavant, nous avons décrit un protocole de détergent-fractionnement abrégé qui a obtenu des résultats comparables aux méthodes de fractionnement séquentiel plus laborieux. 5 en omettant les étapes de fractionnement moins rigoureux, nous avons pu développer un protocole facile seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain post-mortem. 5 ce protocole détaillé décrit ci-après est bien adapté pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et basé sur la spectrométrie de masse protéomique fonctionnelle repliement et ensemencement d’agrégation des analyses. 5 , 6 , 21

Protocole

déclaration d’éthique : tous les tissus du cerveau ont été extraites de l’Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) Banque de cerveaux. Des tissus post-mortem humains ont été acquis en vertu de protocoles appropriés de Institutional Review Board (IRB).

1. homogénéisation et fractionnement

  1. sélection de tissu
    Remarque : Frozen tissus post-mortem de cortex frontal de contrôle sain (Ctl) et pathologiquement AD confirmés ont été sélectionnés parmi la Emory Banque de cerveaux ADRC (n = 2). Évaluation neuropathologique post-mortem de la distribution de plaques amyloïdes a été réalisée selon le Consortium afin de mettre sur pied un registre d’Alzheimer ' s maladie semiquantitative marquant les critères 24, bien que pathologie de l’enchevêtrement neurofibrillaire a été évalué conformément au système de mise en scène de Braak. 16
    1. obtenir congelé des tissus post-mortem de cerveau sain contrôle (Ctl) et pathologiquement AD confirmés. Utilisant des conteneurs de glace sèche, forceps et une lame de rasoir, d’accise ~ portions de 250 mg de matière grise de chaque échantillon de tissu sur jetable taré peser bateaux, en prenant soin d’éviter le tissu de la fonte. Noter le poids de chaque pièce pour être homogénéisés.
    2. D’accise ~ 250 mg de matière grise à l’aide de pinces et rasoir en inspectant visuellement pour localiser l’interface entre la matière grise extérieure et intérieure de matière blanche. Éviter la substance blanche et surtout, un gros vaisseaux sanguins ou régions sanglantes, les méninges ou mater arachnoïdien. Garder les tissus congelés pendant le processus de découpe en travaillant rapidement et fréquemment en plaçant pesage bateau avec tissu cérébral dans des contenants en polystyrène avec glace sèche
    3. Enregistrer le poids exact de matière grise excisé de chaque morceau gelé à l’aide d’une balance analytique. Calculer le volume de tampon hyposodé (LS) (voir tableau 1) nécessaires pour l’homogénéisation dounce (5 mL/g, soit 20 % p/v).
    4. Préparer 10 mL LS tampon avec 1 inhibiteur de la protéase et la phosphatase cocktail et chill sur glace.
    5. Retirer tissu pesé et pesage bateau de glace sèche et dés en morceaux de 2 x 2 mm à peu près comme il dégèle. Transférez dans un tube de homogénisateur de dounce préalablement réfrigérées 2 mL sur glace
    6. Ajouter 5 mL/g (20 % p/v) de tampon hyposodé glacee (LS) avec 1 X cocktail inhibiteur de la protéase et de la phosphatase.
    7. Homogénéisez le tissu cérébral sur la glace en utilisant environ 10 coups de clairance élevée Pilon A et 15 coups de pilon de faible garde B.
    8. Transfert homogénat tous à un tube en polypropylène 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Le tube avec l’étiquette “ TH ” (homogénat Total), le tissu affaire nombre et homogénat volume. aliquote 0,8 mL dans un tube marqué 1,5 mL. L’homogénat tout excès peut être de la même manière aliquotés et congelés à -80 ° C.
    9. à chaque aliquote de 0,8 mL, ajouter 100 µL de chaque de 5 M de NaCl et sarkosyl 10 % (p/v) à des concentrations de 0,5 M et 1 % p/v, respectivement. Mélanger des tubes bien par inversion et incuber sur glace pour les tubes étiquette 15 min. avec " TH-S " (Total homogénat-Sarkosyl) pour indiquer que les homogénats sont en tampon sarkosyl (tableau 1).
    10. Soniquer chaque tube pour trois 5 s Pulse à amplitude de 30 % sur la glace (intensité maximale = 40 %) en utilisant une sonde de microtip.
    11. déterminer les concentrations de protéine des homogénats à l’aide de l’acide bicinchoninic (BCA) dosage 25 méthode.
      Remarque : La concentration de protéine moyenne des homogénats de TH-S préparés à 5 mL LS par gramme de tissu est de 15 à 20 mg/mL. Les homogénats peuvent être fractionnés immédiatement ou conservées à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
    12. Des homogénats de TH-S diluer à 10 mg/mL à l’aide de tampon de sark glacee (tableau 1) avec 1 x inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
    13. Transfert 5 mg protéine (0,5 mL) de chaque homogénat TH-S dans 500 µL en polycarbonate ultracentrifugeuse tubes et de balance des paire avec tampon de Sercq. Charger les tubes dans un rotor préalablement réfrigéré et ultracentrifugeuse à 180 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. transfert le sarkosyl soluble dans les surnageants (S1) pour tubes de 1,5 mL et conserver à -80 ° C.
      NOTE : (En option lavage) ajouter 200 µL de sark-tampon de l’ultracentrifugeuse tubes contenant les fractions insolubles dans un détergent (P1) et déloger les pellets (P1) de la partie inférieure des tubes ultracentrifugeuse à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.
      14. Tubes
    14. brièvement le pouls-spin inversé pour 2-3 s (≤ 2 500 g x) sur une micro-centrifugeuse pour transférer les granulés (P1) et le tampon pour les tubes de 1,5 mL ci-dessous. Resuspendre les pellets insolubles (P1) dans le tampon sark de pipetage de haut en bas afin d’assurer le culot est perturbé.
    15. La paire-balance et centrifuger à 180 000 x g pendant une supplémentaire de 30 min à 4 ° C.
    16. Jeter le surnageant de lavage en option (S2) et incuber les pellets sarkosyl insoluble (P2) dans 50 à 75 µL de tampon de l’urée (tableau 1) avec 1 x PIC (protéase et phosphatase inhibiteur de cocktail) pendant 30 min à température ambiante à solubiliser les Pellet.
      NOTE : Urée chaude tampon à température ambiante avant utilisation pour éviter la précipitation de SDS. Pour les applications sensibles au détergent, omettez SDS du tampon de l’urée et tient compte de laver le culot insoluble (P2) faible tampon salin avant resuspendant dans tampon urée.
    17. Transfert des granulés remises en suspension (P2) aux tubes de 0,5 mL et l’utilisation brève (1 s) microtip sonication à amplitude de 20 % (intensité maximale = 40 %) à solubiliser complètement les plombs.
    18. Déterminer les concentrations de protéine du sarkosyl-soluble (S1) et - insolubles fractions (P2) à l’aide de la BCA de la méthode de dosage. Utiliser ces fractions immédiatement ou conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

2. Immunoblotting

  1. Western blotting
    Remarque : Éponger occidental a été effectuée conformément aux procédures déjà rapportées avec de légères modifications. 5 , 10
    1. préparer 40 µg échantillons totales homogénats (TH-S), sark-soluble (S1), des fractions (P2) sark insoluble dans 1 X Laemmli SDS-page échantillon solution tampon 5 mM PTCE 7. Incuber les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.
      2. Gel d’échantillons
    2. charge sur un préfabriqué 10 puits 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE. ELECTROPHORESE à 80 V pour le premier centimètre (10 min) et 120 V pour le reste (60 min) ou jusqu'à ce que le colorant de repérage atteint le fond du gel.
    3. Utiliser une nouvelle lame de rasoir et couteau de gel pour split-ouvrir la cassette de gel préfabriqué. Couper délicatement les peignes et tout en bas du gel avec une lame de rasoir fraîche.
    4. Remettre en suspension les pellets insolubles (P1) dans 200 µl de sark-tampon avec 1 x PIC de pipetage up ou down.
    5. Transfert d’une membrane de nitrocellulose de 0,2 µm en utilisant une méthode de transfert sec sur une machine de transfert (voir la Table des matières).
    6. Bloquer la membrane dans un tampon bloquant (BB) sans Tween 20 pendant 30 min, suivie avec BB avec 0,05 % Tween 20 (BB/T) pendant 30 min. Après le blocage, rincez la membrane dans SCT/T (0,1 % Tween 20) pendant 5 min enlever l’excès de tampon bloquant.
    7. Préparer des dilutions de 1 : 1 000 de l’anticorps primaire pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 et EEA1 en BB/T (0,05 % de Tween 20).
    8. Incuber les membranes en solution d’anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C sous agitation circulaire. Rincer la membrane au SCT/T pour 3 x 15 min.
    9. Sonde la membrane avec une dilution de 1/20 000 de la fluorescent proche infrarouge secondaires anticorps marqués en BB/T pendant 60 min à température ambiante dans l’obscurité sur l’agitateur. Rincer la membrane pour 3 x 10 min dans SCT/T et 2 x 5 min dans les directives du SCT.
    10. Scan la membrane à l’aide d’un système à la longueur d’onde d’excitation appropriée (p. ex. 700 nm (canal rouge) pour le colorant infrarouge 680 chèvre anti-souris IgG (H + L) secondaire à 800 nm (couche verte) pour teinture infrarouge 790 âne anti-lapin IgG (H + L d’imagerie infrarouge ) secondaire).
    11. Utiliser le logiciel d’imagerie pour quantifier les intensités du signal et d’effectuer des mesures de densitométrie selon le fabricant ' instructions s, assurant le réglage auto-document d’information est défini sur moyen tout l’arrière-plan.

Résultats

Le protocole abrégée seule étape sarkosyl-fractionnement a été utilisé pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent de contrôle et de cerveau post-mortem (Figure 1). Les protéines des fractions TH-S, S1, S2 et P2 ont été résolus par SDS-PAGE, fixée pendant 15 min dans le bleu de Coomassie bleu tampon fixateur suivie d’une coloration douce avec du tampon de coloration bleu de Coomassie brillant bleu G-250. L’étape de...

Discussion

Dans les présentes, nous introduisons et discuter d’un protocole de détergent-fractionnement seule étape abrégé qui s’applique à un large éventail d’applications expérimentales allant d’analyse basé sur la spectrométrie de masse protéomique d’une protéine fonctionnelle mauvais repliement des essais et transfert Western. 5 , 6 , 7 , 10 cette méthodologie est peut-être plu...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient les Drs Jim Lah et Allan Levey, département de neurologie de Emory, des suggestions et des commentaires utiles. Ce travail a été en partie financé par le partenariat de médecine accélérant (U01AG046161-02), le Emory Alzheimer de grant Disease Research Center (P50AG025688) et un National Institute on Aging accordent (R01AG053960-01) à SNRC Cette recherche a été également soutenue en partie par le noyau de neuropathologie de l’octroi d’installations centrales de Emory Neuroscience NINDS, P30NS055077.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)Thermo Fisher78441protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)Fisher ScientificFB505110microtip ultrasonicator
Optimax TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361545refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotorBeckman Coulter362224ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwallBeckman Coulter343776ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample bufferHome-madeN/ASDS-PAGE
TCEP solution, neutral pHThermo Fisher77720reducing agent
(TBS) blocking bufferThermo Fisher37542blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20Thermo Fisher37543blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-wellThermo FisherNW04120BOXprecast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)Sigma AldrichL5777-50Gdetergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibodyChemiconMAB375antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibodyMilliporeMAB5450antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)Thermo FisherMN1020antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibodyabcamab2900antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA21058antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyThermo FisherA11374antibodies
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, miniThermo FisherIB23002Gel transfer

Références

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