Un método General para la detección de formación de Nitrosamide en el metabolismo In Vitro de nitrosaminas por Cytochrome P450s

Resumen

Α-hidroxilación de nitrosaminas carcinógenas por cytochrome P450s es la aceptada vía metabólica que produce intermediarios DNA-perjudiciales, causantes de mutaciones. Sin embargo, nuevos datos indican más a nitrosamidas puede oxidarse. Describimos un general método para la detección de nitrosamidas producido en vitro del citocromo P450-catalizada metabolismo de nitrosaminas.

Resumen

N-nitrosaminas son un grupo bien establecido de carcinógenos ambientales, que requieren la oxidación de la citocromo P450 que exhiben actividad. El mecanismo aceptado de activación metabólica implica la formación de α-hydroxynitrosamines que se descomponen espontáneamente a los agentes alquilantes del ADN. Acumulación de daño en el ADN y las mutaciones que en última instancia puede conducir a cáncer. Nueva evidencia indica que α-hydroxynitrosamines puede estar más oxidado a nitrosamidas processively por cytochrome P450s. Porque nitrosamidas son generalmente más estables que la α-hydroxynitrosamines y también pueden alkylate ADN, nitrosamidas pueden desempeñar un papel en la carcinogénesis. En este informe, describimos un protocolo general para la evaluación de producción de nitrosamide catalizada por la P450 metabolismo de en vitro del citocromo de nitrosaminas. Este protocolo utiliza un acercamiento general a la síntesis de las nitrosamidas pertinentes y un en vitro citocromo P450 metabolismo ensayo usando spectrometry total en tándem cromatografía líquido-nanospray ionización alta resolución para la detección. Este método detecta N′- nitrosonorcotinine como un metabolito menor de N′- nitrosonornicotine en el estudio de ejemplo. El método tiene alta sensibilidad y selectiva debido a la precisa detección de masa. Aplicación de este método a una amplia variedad de sistemas de nitrosaminas-citocromo P450 ayudará a determinar la generalidad de esta transformación. Porque cytochrome P450s son polimórficos y varían en la actividad, una mejor comprensión de la formación de nitrosamide puede ayudar en la evaluación del riesgo individual de cáncer.

Introducción

N-nitrosaminas son una gran clase de carcinógenos en la dieta, productos del tabaco y el medio ambiente en general; también puede ser formados endógenamente en el cuerpo humano¹. Más de 300 N -nitroso compuestos han sido probados y > 90% fueron evaluado como carcinógeno en modelos animales de^2,3. Para exhibir su carcinogenicidad, estos compuestos deben ser primero activados por cytochrome P450s^1,2,3. La investigación muestra que citocromo P450s oxida fácilmente nitrosaminas a α-hydroxynitrosamines (figura 1), que son compuestos altamente reactivos con vidas medias de ~ 5 s antes de descomponerse espontáneamente a alkyldiazohydroxides. Este último puede alkylate la DNA después de la pérdida de H₂O y N₂. Aductores de ADN resultante, si sin reparar, puede causar mutaciones que, en caso de crítica onco - o genes supresores de tumores, cáncer desarrollo¹. Por esta razón mucho esfuerzo se ha expendido para adquirir un conocimiento completo de las rutas metabólicas, aductores de ADN y aguas abajo metabolitos de la oxidación de la citocromo P450 de nitrosaminas carcinógenas. Este conocimiento tiene aplicación potencial en de evaluación de riesgo individual de cáncer⁴.

Figura 1: General y metabolismo propuesto de nitrosaminas.
Nitrosaminas (1) se oxidan por P450s a α-hydroxynitrosamines (2) que se descomponen espontáneamente a alkyldiazohydroxides (3). Estos compuestos pueden atar a la DNA para formar que aductos de ADN. Se presume que 2 más son oxidados por P450s nitrosamidas 4. Estos pueden enlazar directamente ADN para formar nuevo ADN aductos o ser hidrolizada a 3 para formar que aductos de ADN conocida. R₁ y R₂ representan cualquier grupo Alquilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aunque la hipótesis de α-hydroxynitrosamine esté solidamente apoyada por datos de amplia, hay algunas inconsistencias; uno importante es la vida media corta de α-hydroxynitrosamines^5,6. Es conocido que estos compuestos se producen en la membrana del retículo endoplásmico y posteriormente alkylate la DNA nuclear. Teniendo en cuenta la vida de unos pocos segundos, es desconcertante cómo estos intermedios sobreviven el viaje requiere sin embargo el citosol. Una hipótesis es que una porción de la α-hydroxynitrosamines se processively oxidan a nitrosamidas^7,8, que son bastante estables en comparación⁹. Esto probablemente ocurre vía retención de α-hydroxynitrosamines en el sitio de activo de citocromo P450. Precedente para este tipo de oxidación se ha visto con nicotina¹⁰, alcoholes¹¹y^12,de alkylnitrosamines simple¹³. Además, nitrosamidas son carcinógenos de acción directa^2,3. Basado en su reactividad⁹, estos compuestos se creen producir ADN aductos idénticas a las derivadas de α-hydroxynitrosamines junto con el nuevo, inexplorado ADN aductos (figura 1). Así, esta hipótesis no sólo explica el transporte a través del citosol, sino también la formación de ADN dañar productos.

En este artículo se describe un protocolo general para la evaluación del en vitro del citocromo P450-mediated conversión de nitrosaminas en nitrosamidas. La conversión previamente divulgada de N′- nitrosonornicotine (NNN) N′- nitrosonorcotinine (NNC) por citocromo P450 2A6 es presentada como un ejemplo¹⁴. Aplicación del presente Protocolo para una amplia gama de sistemas de la enzima substrato ayudará a determinar la importancia de nitrosamidas en metabolismo total de nitrosamina.

Protocolo

1. materiales y procedimientos generales de

1. sintetizar NNN como describió anteriormente ¹⁵. Obtener norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneración de NADPH, tampón de reacción de 0.5 x y todos los otros productos químicos o solventes de fuentes comerciales en grado reactivo.
2. Espectros de RMN de registro en un espectrómetro de 500 MHz. Cambios químicos de informe como partes por millón (ppm). Utilizar picos de solvente residual como referencias internas para ¹ H-NMR (7,26 ppm CDCl ₃) y ¹³ C-RMN (77,2 ppm CDCl ₃).
   Nota: Pico partir utiliza las siguientes abreviaturas: s = camiseta, d = doblete, dd = doblete de Dobletes, dt = doblete de tríos, dq = doblete de cuartetos, ddd = doblete de doblete de Dobletes y m = multiplet.
3. Realizar espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) para compuestos seleccionados en un LTQ Orbitrap Velos y los datos como m/z.
4. Uso polygram cubierto primero placas de Silicagel TLC (40 mm x 80 mm, 0,2 mm de espesor) con indicador fluorescente de 254 nm para cromatografía en capa fina (TLC). Visualizar las placas de TLC por la irradiación UV lámpara.
5. Realizar la cromatografía flash sobre un 60 Å, gel de silicona de 70-150 mesh usando una columna de vidrio de 1,5 cm x 15 cm.

2. Preparación del control positivo de nitrosamide (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)

1. seco, en un horno durante la noche (16 h, ~ 140 ° C), 25 mL, matraz de fondo redondo que contiene una barra de agitación magnética. En la mañana, frío el matraz bajo una secuencia de N ₂ mientras con un burbujeador de aceite para mantener el flujo de N ₂ tarifa bajo una burbuja por segundo.
   Nota: Después de enfriar, las precauciones para mantener el matraz bajo N ₂ no son necesarias.
2. En una campana de humos, añadir norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), anhídrido acético (5 mL) y ácido acético (1 mL) al matraz enfriado. Revuelva la mezcla continuamente mientras se enfría a 0 ° C con un baño de hielo de agua.
   PRECAUCIÓN: Anhídrido acético y el ácido acético están corrosivos.
3. NaNO agregar ₂ (33,3 mg, 0.483 mmol) en una porción y agitar continuamente la mezcla para monitorear el avance de la reacción por el TLC de 2,5 h. (100% EtOAc, R _f = 0.19, consulte el paso 1.4).
   Nota: Durante este tiempo, la mezcla se convertirá en cada vez más amarilla con burbujas ocasionales.
4. Calmar la reacción vertiendo la mezcla en helado de H ₂ O (18 mL). Extraer inmediatamente la solución acuosa con 18 mL de CH ₂ Cl ₂ en un matraz de 100 mL. Extraer la capa acuosa de al menos 2 veces más con CH ₂ Cl ₂ (9 mL).
5. Seco de la materia orgánica combinada más de ~ 100 mg MgSO ₄ min 2 filtro y concentrar la solución por evaporación rotatoria para producir un aceite crudo, amarillo. El baño de agua a 30 ° C de calor durante la evaporación para eliminar el ácido acético residual.
   Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí si el compuesto se disuelve en la solución almacenada en la oscuridad a 2-8 ° C. y CH ₂ Cl ₂
6. Purificar el crudo compuesto por cromatografía en columna (ver paso 1.5) usando gel de sílice como fase estacionaria y 100% EtOAc como eluyente ¹⁶.
   PRECAUCIÓN: NNC y nitrosamidas relacionados deben ser manejados con cuidado ya que se supusieron que son carcinógenos humanos.
7. Disolver el compuesto puro en CDCl ₃ y usar NMR (vea el paso 1.2) para confirmar la estructura y determinar la molaridad de esta solución ¹⁷. Almacenar esta solución en la oscuridad a 2-8 ° C hasta que sea necesario.
   Nota: Esta solución se usará como control positivo en el ensayo en vitro (paso 3.5). Espectros de RMN y los cambios químicos están disponibles en la información de apoyo a.
8. Con una solución pura de NNC, confirmar la exacta masa los padres y determinar masas de productos ion por infusión directa en un espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) bajo los parámetros descritos en los pasos 1.3 y 4.3.
   Nota: Las masas de producto se utilizarán para la detección de este compuesto en el en vitro ensayo metabolismo (paso 4.3).

3. Una nitrosamina-P450 en vitro incubación de ejemplo

1. Retire P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneración de NADPH Vivid y 10 mM NADP ⁺ solución madre de un congelador de-80 ° C y dejarlos descongelar en el hielo. Una vez descongelado, diluir la Baculosomes y sistema de regeneración de NADPH 1:10 y 1:50, respectivamente, en un tubo solo 1 mL con 0,5 reacción X Buffer. Del mismo modo, agregar 3 μL de NADP ⁺ solución Stock a 97 μL de 0, 5 X Buffer de reacción.
   Nota: NADP ⁺ es sensible a la luz. Mantener esta solución protegida envolviendo su envase en papel de aluminio. Soluciones enzimáticas son sensibles a los ciclos hielo-deshielo; Esto se limita a no más de 2 ciclos. Preparar alícuotas según sea necesario para futuros experimentos.
2. Para cada incubación, añada 50 μL de solución enzimática (contiene 5 pmol de P450) a un 1 mL del tubo que contiene 40 μL de solución NNN μM 4 hecho con tampón de reacción. Incubar previamente esta nueva mezcla por 2 min a 37 ° C utilizando un baño de agua y añadir 10 μL de la solución diluida de NADP ⁺. Incubar el sistema completo para 1-30 min a 37 ° C.
   Nota: Con intervalos de 5 min para tiempos de incubación (por ejemplo 5, 10, 15 minutos, etc.) le proporcionará un curso de tiempo suficiente de nitrosamide formación.
3. Después del tiempo de incubación deseados, apagar primero agregando 10 μl de 3.0 N ZnSO ₄ y luego 10 μL de 3.0 N Ba(OH) _2. Vórtice que se forman de esta solución y un precipitado blanco. Centrifugar la muestra a 8000 x g por 4 min a pellet precipitado.
   Nota: El procedimiento no debe detener en este paso como las nitrosamidas formados tienen una limitada estabilidad en soluciones acuosas. Largas pausas pueden resultar en falsos negativos.
4. Inmediatamente pipetear el sobrenadante y analizar 2 μL por cromatografía líquida positiva nanoelectrospray-ionización alta resolución tandem espectrometría de masas (LC-NSI ⁺-HRMS/MS, los pasos 4.1-4.3).
5. Para incubaciones de control positivo, se evapora una alícuota que contenga 100 fmol de solución NNC sintetizada en un tubo 1 mL bajo una corriente de N ₂. A este frasco, agregue el sistema enzimático completo del paso 3.2 y proceder como se describe por pasos 3.3-3.4.
6. Para incubaciones de control negativo, realizar el experimento descrito (pasos 3.2-3.4) excepto sustituir los 50 μL enzima solución con 0,5 X buffer de reacción.

4. Ejemplo de parámetros para la detección de nitrosamide por LC-NSI ⁺-HRMS/MS

componente de

1. de la LC, el siguiente gradiente de múltiples paso en el paso 4.2 se aplican a un sistema UPLC con un comercial, repleto de mano ¹⁸ C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, columna capilar de 15 μm orificio.
2. Usando 5 mM NH ₄ OAc como A solvente y MeCN como disolvente B, carga la muestra en la columna ejecutando 5% B a 1 μL/min. de 0 - 5 min y luego desacelerando la tasa de flujo de 0,3 μL/min luego. A continuación, ejecute un gradiente de 5 a 20% B durante 4 min, seguido de una rampa hasta el 55% B más de 10 minutos y luego volver a equilibrar al 5% B.
3. Realizar la LC-NSI ⁺-HRMS/MS en un LTQ Orbitrap. Monitor para la NNC por análisis completo y MS ² fragmentación. Realizar un análisis completo con una resolución de 60.000 y extraer la masa exacta del padre (192.07670) en una tolerancia de masa de 5 ppm. Uso MS ² fragmentación aislar padre iones (2,0 amu) y fragmento de colisión-inducida disociación (CID) con una energía de colisión de 25 eV, resolución de 15.000, y análisis de tiempo de 30 Sra. extraer las masas exactas de los iones producto de NNC (m/z 192 m/z 134.04739 y 162.07874) en una tolerancia de masa de 5 ppm.

Resultados

Basado en la obra de blanco et al. ¹⁹, norcotinine era nitrosados a NNC limpia y en alto rendimiento (80-92%) para producir un estándar para el experimento en vitro . Se obtuvo evidencia estructural para una reacción exitosa de análisis espectroscópico como ¹H-NMR, ¹³C-RMN, COSY, HSQC (información de apoyo) junto con HRMS que confirmó el padre de masa [M + H]⁺ de 5 ppm de los valor teórico (

Discusión

Dilucidar el metabolismo de las nitrosaminas es un elemento fundamental para entender su carcinogenicidad. Puesto que el implicado cytochrome P450s y otras enzimas metabólicas son polimórficos, aplicación de este conocimiento potencialmente podría identificar individuos de alto riesgo^1,4. Nueva información indica más oxidación de α-hydroxynitrosamines, los principales metabolitos presumidos de nitrosaminas implicados en el atascamiento de la DNA, nitrosam...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Norcotinine	AKoS GmbH (Steinen, Germany)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	242845
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	431311
Barium Hydroxide	Sigma-Aldrich	433373
D-Chloroform	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Chloride	Sigma-Aldrich	34856
Sodium Nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit	Life Technologies	PV6140
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	221376
0.5 mL tubes	Fisher	AB0533
100 mL round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z510424
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS4980125
125 mL Separatory Funnel	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman-Coulter
LC vials	ChromTech	CTC–0957–BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Magnetic Stir bar	Sigma-Aldrich	Z127035
NMR tube	Sigma-Aldrich	Z274682
P1000, P200, and P10 pipettes	Eppendorf
Rotary evaporator	Sigma-Aldrich	Z691410
RSLCnano UPLC system	Thermo Scientific
Shaking Water Bath	Fisher	FSSWB15
Stir plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420
PicoFrit Column	New Objective	PF3607515N5
Luna C18, 5 um	Phenomenex	535913-1