Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección

Resumen

Smut hongos causan muchas enfermedades agrícolas devastadoras. Se dispersan como teliosporas latentes que germinan en respuesta a señales ambientales. Describiremos dos métodos para investigar cambios moleculares durante la germinación: aumento de la respiración para detectar la activación metabólica de medición y evaluación cambiar acontecimientos moleculares aislando teliosporas en etapas morfológicas distintas.

Resumen

Smut hongos son los agentes etiológicos de diversas enfermedades agrícolas devastadoras. Se caracterizan por la producción de teliosporas, que son agentes de dispersión de paredes gruesas. Teliosporas pueden permanecer latentes durante décadas. La latencia se caracteriza por bajas tasas metabólicas, biosíntesis macromolecular en pausa y reduce los niveles de respiración. Sobre la recepción de señales ambientales requiere, teliosporas germinan para producir células haploides, que pueden iniciar nuevas rondas de la infección. Germinación de la Teliospora se caracteriza por la reanudación de la biosíntesis macromolecular, respiración creciente y dramáticos cambios morfológicos. Para medir con precisión cambios en la respiración celular en las primeras etapas de la germinación, hemos desarrollado un protocolo simple que emplea un respirómetro tipo Clark. Las últimas etapas de la germinación se distinguen por cambios morfológicos específicos, pero la germinación es asincrónica. Hemos desarrollado una técnica de microdisección que nos permite recoger teliosporas en etapas distintas de la germinación.

Introducción

Los hongos de carbones (Ustilaginales) consisten en más de 1.600 especies que infectan gramíneas incluyendo los cereales importantes de maíz, cebada y trigo, causando miles de millones de dólares en pérdidas en los cultivos anuales¹. Estos hongos se caracterizan por la producción de teliosporas, que han pigmentado oscuro las paredes celulares y son los agentes de dispersión. Teliosporas función para proteger el material genético durante las tensiones de la dispersión entre plantas hospederas y pueden persistir en estado latente por años². Como tal, teliosporas son un componente esencial de la extensión de la enfermedad.

Para estudiar la biología de esta, nuestro laboratorio utiliza el hongo modelo de smut Ustilago maydis (U. maydis), que es el agente causal de la enfermedad 'carbón común del maíz'. Madura U. maydis teliosporas se caracterizan por detención del crecimiento, metabolismo celular reducida y bajos niveles de respiración celular³. En condiciones ambientales favorables (por ej., la presencia de azúcares específicos), U. maydis teliosporas germinan y completar basidiosporas de meiosis, produciendo que pueden iniciar nuevas rondas de la infección. Germinación se caracteriza por respiración creciente, la actividad volver a metabólico y la progresión a través de etapas morfológicas observables de germinación⁴.

La etapa inicial de germinación incluye aumento de la respiración y la función metabólica, sin embargo, hay no hay indicaciones morfológicas de cambio. Las medidas originales del cambio respiratoria en U. maydis se llevaron a cabo más de 50 años, medir el consumo de oxígeno manometrically con un frasco de Warburg aparato⁵. Hemos desarrollado un método nuevo, simple de estudiar cambios precisos en la respiración durante la germinación de la Teliospora midiendo el consumo de oxígeno durante un tiempo de germinación utilizando un microrespirometer de tipo Clark. Anteriormente utilizamos este método para estudiar cambios en la frecuencia respiratoria entre el tipo salvaje células haploides de U. maydis y mutantes con mitocondrias defectuosas⁶y han adaptado el protocolo aquí para estudiar cambios en la respiración de esta durante germinación. Esto proporciona un medio de identificar con precisión el momento del cambio de la respiración por lo que podemos apuntar teliosporas en el momento apropiado después de la iniciación de la germinación para investigar los eventos moleculares tempranos. La progresión de la germinación puede ser seguida microscópicamente una vez el promycelia sale de la Teliospora, pero la naturaleza asíncrona inhibió el aislamiento de suficiente teliosporas en una etapa determinada de investigación. Hemos desarrollado una técnica de microdisección similar a los utilizados para la fertilización in vitro para recoger físicamente teliosporas en distintas etapas morfológicas de la germinación.

Protocolo

1. maíz mazorca infección

1. Zea mays (CV. gallo de oro) de crecer hasta que las mazorcas están formadas y han comenzado a seda (aproximadamente 60 días).
2. Cultivo de haploides compatibles U. maydis cepas utilizando protocolos estándar como se ha describen⁷.
3. Infectar las mazorcas de maíz usando protocolos estándar como se describió anteriormente⁷.

2. esta cosecha

1. Equipo de autoclave (embudos Büchner, frascos de Büchner, licuadoras, botellas de centrífuga de 250 mL, espátulas planas y agua) utilizando un estándar seco ciclo con al menos 30 min esterilización a 121 ° C (ciclo líquido estándar para el agua).
2. Eliminar las mazorcas infectadas de las plantas (aproximadamente post infección de 28 a 35 días) utilizando una maquinilla de afeitar y las mazorcas en una bandeja cubierta de protector de banco.
3. Quitar los tumores de las mazorcas con una cuchilla de afeitar y recoger en un vaso de precipitados.
4. Llene un vaso de licuadora de laboratorio de 250 mL con tumores hasta aproximadamente 1/3 por completo y añadir autoclave dH₂O hasta que la taza de la licuadora es aproximadamente 3/4 completo. Interrumpir los tumores por pulsación la batidora en mínimo, hasta homogeneizada.
5. Conecte la bomba de vacío a una trampa de agua y luego a un frasco de Büchner 1 L.
6. Inserte el embudo de Büchner grande en el matraz y forre el fondo del embudo Büchner con cuatro capas de Gasa.
7. Encienda la bomba de vacío.
8. Vierta una porción de los tumores homogeneizadas a través de la estopilla y raspar con una espátula.
9. Verter algunos dH₂O en la estopilla para eliminar las teliosporas a través.
10. Repetir hasta el dH₂O a través de la estopilla está claro.
11. Escurra la estopilla que contiene el material homogeneizado tumor en el filtro para garantizar la recuperación de esta máxima.
12. Cuando el frasco de Büchner 1 L está cerca completo, vaciar en un matraz de Erlenmeyer grande y póngala a un lado.
13. Poner un nuevo trozo de cañamazo en el filtro y repetir los pasos (2.7 – 2.12) hasta que todos los tumores se han interrumpido y filtrado.
14. Vierta las teliosporas filtrados en botellas de centrífuga esterilizado 250 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.
15. Repita paso 2.14 hasta todas las teliosporas filtradas son peleteados por centrifugación.
16. Suspender las pastillas en una pequeña cantidad de agua y transferir a tubos de centrífuga de 50 mL.
17. Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.
18. Suspender el pellet en aproximadamente 50 mL de dH₂O centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante. Raspe suavemente la capa superior gris con una espátula y disponer de él. Repita hasta que ya no hay una capa gris en la parte superior.
19. Seco las muestras durante la noche en un desecador de vacío.
20. Almacenar teliosporas secas a 4 ° C hasta su uso.
21. Si lo desea, tratar las teliosporas con sulfato de cobre⁸ antes de inducir la germinación. Si no se trata, realizar análisis microscópico exhaustivo de las teliosporas para confirmar que la muestra representa teliosporas puros y carece de bacterias u otras contaminaciones.
    1. Pesar aproximadamente 50 mg de teliosporas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Añadir 1,0 mL aproximadamente de 0,75% CuSO₄ al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo las teliosporas. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para suspender las teliosporas en la solución de CuSO₄ seguida por agitar la muestra durante 3 horas.
    3. Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de esta con agua estéril y repita la centrifugación, eliminar el sobrenadante.
    4. Repita el paso 2.21.3 dos veces más.

3. esta viabilidad y prueba de germinación

1. Pesar aproximadamente 10 mg de teliosporas de U. maydis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para evaluar su viabilidad y el momento de la germinación.
2. En un gabinete de bioseguridad, preparar caldo dextrosa de papa (PDB, 24 g/L) suplementado con sulfato de estreptomicina (160 μg/mL).
3. Suspender las teliosporas en 500 μl de PDB. Pipetee suavemente para mezclar y dispersar los grumos de teliosporas.
4. Transferir la suspensión de esta en una autoclave 250 mL matraz Erlenmeyer que contenía 10 mL de la PDB.
5. Incube el frasco a 28 ° C agitando a 90 rpm durante 12 a 16 h.
6. En un gabinete de bioseguridad, saque un 20 μl de muestra de las teliosporas inducidas a germinar y a preparar un portaobjetos de microscopio.
7. Visualmente con un microscopio, evaluar las etapas de germinación que se presentan y la presencia de contaminación bacteriana.
   1. Contar el número de teliosporas en etapas I a V utilizando un hemocitómetro y determinar el por ciento que ha germinado.
   2. Si sólo la etapa I teliosporas están presentes, continúan Incube el frasco para un total de 24 h antes de evaluar la germinación de la Teliospora. Continuar la incubación durante un máximo de 48 h antes de considerar la muestra no viables.
   3. Si hay contaminación bacteriana, complementar el PDB con el sulfato de kanamicina (50 μg/mL) y estreptomicina (160 μg/mL) y repita los pasos 3.1 a 3.7. Si persiste la contaminación bacteriana, tratamiento de teliosporas con sulfato de cobre y repita los pasos 3.1 a 3.7.

4. inducción de germinación para el control de la respiración

1. Pesan igual cantidad (por ej., 50 mg) de teliosporas para cada experimento de respiración.
2. En un gabinete de bioseguridad, añadir teliosporas a una cámara de respiración esterilizado.
3. Llenar la cámara con PDB (24 g/L) suplementado con estreptomicina (160 μg/mL) y kanamicina sulfato (50 μg/mL).
4. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de esta.
5. Colocar la tapa de la cámara en la cámara para crear sello hermético.

5. obtención de las mediciones de tasa (OCR) de consumo de oxígeno

1. Coloque la cámara en la rejilla de la cámara dentro de un baño de agua (precalentada a 28 ° C).
2. Coloque la sonda de₂ O dentro de la abertura de la cámara.
3. Supervisar los puntos de datos en tiempo real en el programa "SensorTrace Rate" y que la sonda estabilizar (~ 3 minutos después de que la sonda se coloca en la cámara).
4. Haga clic en "Medida" para medir O₂ niveles continuamente durante 6 h con medidas en intervalos s 2.
5. Detener la medición y repita los pasos 4.1-5.4 para cada muestra a analizar.
6. Exportar los datos a Microsoft Excel haciendo clic en "archivo | De exportación | Guardar como xls".

6. Análisis de datos

1. Calcule OCR
   1. En el archivo de Excel exportado bajo la pestaña de "Within_Rates", grabar la "tasa" para cada medición de cámara (nmol/h).
   2. Para cada muestra experimental, reste la "tasa" de la cámara en blanco de la "tasa" de la cámara de muestras experimentales para obtener un valor corregido de OCR y tomar el valor absoluto de este número.
   3. Calcular el total OCR por mg de teliosporas dividiendo el valor de OCR absoluto corregido por el celu utilizado masa.
   4. Medio de replicar los valores "OCR por mg de teliosporas" para cada cepa.
2. Analizar los datos utilizando el método estadístico adecuado (por ej., de student t-test, análisis de varianza) con Microsoft Excel de otro software de estadística.
3. Para ver datos, calcular el porcentaje de oxígeno restante para cada punto del tiempo que desea ver. Divida la primera lectura por sí mismo multiplica por 100 (100% oxígeno restante), luego divida cada lectura posterior por la primera lectura y multiplica por 100 para obtener el porcentaje de oxígeno en la cámara.

7. inducción de la germinación de la Teliospora para aislar teliosporas en distintas etapas de la germinación

1. Preparar el PDB (24 g/L) suplementado con sulfato de estreptomicina (160 μg/mL) en un gabinete de bioseguridad.
2. Colocar aproximadamente 10 mg de teliosporas de U. maydis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Suspender las teliosporas en 500 μl de PDB. Pipetee suavemente para mezclar hasta que no queden grumos de teliosporas en el medio.
4. Transferir la suspensión de esta a un erlenmeyer de 250 mL esterilizado con PDB suplementado con sulfato de estreptomicina.
5. Incube el frasco durante la noche 28 ° C agitando a 90 rpm.

8. preparación de la placa de Petri y amalgamas dentales

1. Preparar un plato de Petri (57 cm²) por pipeteo filas de gotas para la preparación de microcapillary y recogida de muestras.
   1. Pipetear 5 gotas de₂O de dH μl (x 4) en la parte superior de la caja Petri.
   2. Pipeta (x3) de 2 μl de la solución de estabilización de RNA en la caja Petri para recogida de muestras.
   3. Pipetear 5 gotas de la germinación de teliosporas en la caja Petri μl (x 30).
2. Añadir 15 mL de aceite mineral a la caja Petri. Asegurar que todas las gotitas están cubiertas por el aceite antes de proceder.
3. Preparar un microcapillary con un diámetro interno de 15 μm, brida de 1 mm, 55 mm de longitud y un ángulo de punta 20° colocando en el soporte de microcapillary y sumergirse en el aceite mineral donde acción capilar permitirá que el aceite mineral entrar en el microcapillary. Libere la presión en el microcapillary antes de llevar a la gota de agua. Aspire para preparar la microcapillary con agua.

9. aislamiento de la fase específica de la germinación de teliosporas

1. Utilizando los controles de las amalgamas dentales, hacia el microcapillary preparado una de las gotitas de la germinación. Penetrar en la gota, baje el microcapillary y llevar la boca de la microcapillary hasta una Teliospora de germinación en la fase de germinación de interés.
2. Aspirar lentamente para capturar la germinación de la Teliospora. Dejar de aspirar una vez que el esta ha entrado en la microcapillary. Repita hasta que hay aproximadamente cinco teliosporas en lo microcapillary.
3. Aumentar la microcapillary con el instrumental quirúrgico y llevar a la gota de colección de solución de estabilización de RNA. Penetrar la gota e inyectar las teliosporas a la gota.
4. Repita los pasos 8.1 a 8.3 hasta aproximadamente 1.000 teliosporas han sido capturados.

10. recuperación de la colección de la gotita

1. Pipeta hasta la gota de la colección y la transferencia a la tapa de un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL libre de DNasa/Rnasa. Retire con cuidado el aceite mineral con una pipeta sin molestar a la gota de la colección.
2. Utilice las teliosporas para aplicaciones posteriores, tales como aislamiento de RNA.

Resultados

Usando el Clark-tipo microrespirometer-método basado en medir los cambios en la respiración durante esta Dormición y germinación, confirmamos que latente teliosporas exhiben un bajo nivel de la respiración (~ 1.075 μmol/h/mg) en comparación con el de la germinación teliosporas (~ 2.614 μmol/h/mg; Figura 1A). Esto representa un cambio de ~2.4-fold en la tasa promedio de respiración entre teliosporas latentes y teliosporas que han sido inducidos a ger...

Discusión

Patógenos foliares de basidiomicetos causan miles de millones de dólares en pérdidas en los cultivos anuales. La gran mayoría de estos patógenos produce teliosporas que son parte integrales de hongos dispersión y reproducción sexual. Obtener conocimiento del desarrollo y la germinación de teliosporas es fundamental para comprender la propagación de las devastadoras enfermedades causadas por estos hongos. Con el fin de identificar cambios moleculares en los puntos clave de control hemos ideado un método para ide...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004