Microrespiration 分析と顕微解剖を使用して冬の発芽を調査

要約

クロボ菌類は、壊滅的な農業の多くの病気を引き起こします。彼らは環境のキューに応答で発芽休眠の寄主として分散しています。発芽過程における分子の変化を調査する 2 つの方法の概要を説明: 呼吸増加代謝活性化を検出するための測定と形態学的段階に寄主を分離することによって変化する分子イベントを評価します。

要約

クロボ菌類は、いくつかの壊滅的な農業病気の病因のエージェントです。彼らは肉厚分散エージェントである寄主の生産によって特徴付けられます。寄主は、何十年も休眠することができます。休眠は、低代謝率によって特徴付けられる、高分子生合成を一時停止し、呼吸のレベルを大幅に削減します。必要な環境シグナルを受け取ったら、寄主は感染症の新ラウンドを開始することができます半数体の細胞を生産する発芽します。冬の発芽は、高分子合成、高められた呼吸および劇的な形態学的変化の再開によって特徴付けられます。発芽の初期段階中に細胞呼吸の変化を正確に測定、するためにクラーク型呼吸度計を用いた単純なプロトコルを開発しました。発芽の後の段階は特定の形態学的変化によって区別されますが、発芽は非同期です。我々 は異なる発芽段階で寄主を収集するために私たちができる顕微解剖技術を開発しました。

概要

黒穂病菌 (Ustilaginales) から成っている牧草、トウモロコシ、大麦、小麦の重要な穀物を含む作物の損失のドルの十億を引き起こす感染以上 1,600 種年間¹。これらの菌は、寄主細胞壁を発色が暗く、散布剤の生産によって特徴付けられます。寄主はホスト植物の間分散のストレスの中に遺伝物質を保護するために機能し、²年間休止状態で保持できます。そのため、寄主は病気の広がりの重要なコンポーネントです。

冬の生物学を研究するためには、当研究室は、モデル黒穂病菌経路(米国アルテリシジン) 'トウモロコシの共通黒穂病' 病気の原因物質であるを利用しています。成熟した米国アルテリシジン寄主は増殖停止、減らされた細胞の代謝と細胞呼吸³の低レベルによって特徴付けられます。有利な環境条件 (e.g。、特定の糖の存在)、米国アルテリシジン寄主が発芽し、減数分裂、生産担子胞子による感染症の新ラウンドを開始することができますこれを完了。発芽は、高められた呼吸、代謝に戻り活動、発芽⁴の観察可能な形態学的段階を経て進行が特徴です。

発芽の初期段階に高められた呼吸と代謝機能が含まれています、ただし、変更の形態学的兆候がないです。米国アルテリシジンの呼吸の変化の元の測定は Warburg フラスコ装置⁵マノメーターで高い酸素消費を測定 50 年以上前に行われました。クラーク型 microrespirometer を使用して発芽の時間経過とともに酸素消費量を測定することによって冬発芽時における呼吸の正確な変化を研究する新しい、シンプルな方法を行った。野生型の呼吸速度の変化を研究するこのメソッドが以前米菌細胞の倍加と不良ミトコンドリア⁶、変異体中に冬の呼吸速度の変化を勉強するここのプロトコルを適応していると発芽。これは早い分子でき事を調査するため発芽開始後の適切な時期に寄主を対象することができますようにする呼吸の変更のタイミングを正確に識別できる手段を提供します。一度、冬から、promycelia が出てくるが、非同期の性質は調査の特定の段階で十分な寄主の分離を抑制、発芽の進行は顕微鏡的続くことができます。我々 は、物理的に発芽の形態学的段階で寄主を収集する体外受精に使用するものと同様レーザーマイクロダイ セクション技術を開発しました。

プロトコル

1. トウモロコシ穂軸感染

1. トウモロコシ(品種黄金のバンタム) の成長まで、穂軸が形成され、シルク (約 60 日) を開始しています。
2. 互換性のある半数米アルテリシジンの文化系統の前述の標準プロトコルを使用して説明⁷。
3. 前述⁷として標準プロトコルを使ってトウモロコシの穂軸に感染します。

2. 冬の収穫

1. オートクレーブ装置 (ファンネルを Büchner、フラスコを Büchner、ミキサー、遠心瓶 250 mL、フラットのへら、水) 121 ° C (標準的な水の液体のサイクル) で少なくとも 30 分滅菌のサイクル乾燥標準を使用して。
2. かみそりを使用して植物 (約 28-35 日ポスト感染) から感染したコブを削除し、ベンチ プロテクターで覆われているトレイに穂軸を設定します。
3. かみそりの刃で穂軸から腫瘍を削除し、ビーカーに収集します。
4. 腫の約 1/3 フルまで 250 mL 研究所ブレンダー カップを埋めるし、ブレンダー カップが約 3/4 までオートクレーブ dH₂O を追加検討します。腫瘍が均質になるまで低速、ミキサーをパルスで中断されます。
5. 水トラップを放置して 1 L 吸引ビンは、真空ポンプを接続します。
6. フラスコを Büchner の大きい漏斗を挿入し、寒冷紗の 4 つの層を Büchner じょうごの底を並べ。
7. 真空ポンプをオンにします。
8. ヘラで寒冷紗とこすりを通じて均質化腫瘍の部分を注ぐ。
9. 寄主をフラッシュするために、寒冷紗にいくつか dH₂O を注ぐ。
10. DH₂まで繰り返し、寒冷紗を通って来る O は、明らかです。
11. 最大冬復旧できるようにフィルターに均質化腫瘍物質を含む寒冷紗を絞る。
12. 1 L 吸引ビンが近くなっている場合完全な大きなエルレンマイヤー フラスコに空、脇に置いておきます。
13. 寒冷紗の新しい作品を入れて、フィルターと腫瘍のすべてが破壊されているし、フィルターまで (2.7-2.12) の手順を繰り返します。
14. フィルター処理された寄主を注ぎオートクレーブ 250 ml 遠心分離機、1,000 x g で 5 分間遠心し、上清をデカントします。
15. 遠心分離によってペレットすべてフィルター処理された寄主のされるまで、手順 2.14.
16. 少量の水と 50 mL 遠沈管への転送でペレットを中断します。
17. 5 分、1,000 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。
18. DH₂O の約 50 mL にペレットを中断、5 分、1,000 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。優しくへらと処分灰色のトップ層をこすり。上はグレーのレイヤーがされなくなるまでを繰り返します。
19. 乾燥試料は真空デシケータで一夜します。
20. 使用するまで 4 ° C で乾燥した寄主を格納します。
21. 必要な場合は、発芽に誘導する前に硫酸銅⁸寄主を扱います。扱われていない場合は、細菌や他の汚染を欠いている、純粋な寄主を表すサンプルを確認する寄主の徹底的な顕微解析を実行します。
    1. 50 mg を約 1.5 mL 遠心チューブに寄主を重量を量る。
    2. 寄主を含む 1.5 mL 遠心チューブに 0.75% CuSO₄の約 1.0 mL を追加します。ピペットの上下の攪拌 3 h のサンプルに続いて CuSO₄ソリューション、寄主を中断します。
    3. 5 分間 2,500 x g でサンプルを遠心し、上清を除去します。滅菌水で冬のペレットを再懸濁します、遠心分離を繰り返し、上澄みを除去します。
    4. 2.21.3 のステップを 2 回繰り返します。

3. 冬の生存率及び発芽試験

1. 彼らの生存率を評価するために 1.5 mL 遠心チューブに米国アルテリシジン寄主の約 10 mg と発芽のタイミングを重量を量る。
2. バイオ セーフティ キャビネット、ストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL) を添加したジャガイモ デキスト ロース スープ (PDB、24 g/L) を準備します。
3. PDB の 500 μ L で、寄主を中断します。優しくのピペットをミックスし、寄主のすべての塊を破る。
4. 冬のペンションをオートクレーブ 250 mL PDB の 10 ml 三角フラスコに転送します。
5. 28 ° c 12-16 h 90 rpm で振盪フラスコを孵化させなさい。
6. バイオ セーフティ キャビネット、発芽し、顕微鏡スライドを準備する誘導寄主の 20 μ L のサンプルを削除します。
7. 顕微鏡を使用して、存在している発芽の段階と細菌汚染の有無を視覚的に評価します。
   1. 寄主の数を数える V 診断の使用を行うし、発芽率を決定します。
   2. 場合にのみステージ I 寄主が存在、冬発芽を評価する前に 24 時間の合計はフラスコをインキュベートし続けます。非実行可能なサンプルを認める前に最大 48 時間の培養を続けます。
   3. 細菌汚染が存在する場合ストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL)、硫酸カナマイシン (50 μ g/mL) PDB を補完し、手順 3.1 から 3.7。細菌汚染が解決しない場合、硫酸銅と寄主を扱う、手順 3.1 から 3.7.

4. 呼吸を監視するため発芽の誘導

1. 同量の重量を量る (e.g。、50 mg) 各呼吸実験の寄主の。
2. バイオ セーフティ キャビネット、寄主をオートクレーブ呼吸室に追加します。
3. ストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL) とカナマイシン硫酸塩 (50 μ g/mL) 塗りつぶし PDB (24 g/L) とチャンバーが補われます。
4. 上下のピペット冬の懸濁液を作成します。
5. 気密のシールを作成する商工会議所の商工会議所のふたを配置します。

5. 酸素消費率 (OCR) 測定値を得る

1. 商工会議所ラック (28 ° C に予熱) 水浴中でチャンバーを配置します。
2. オープニングの中商工会議所の O₂プローブを配置します。
3. 「SensorTrace レート」プログラム上でリアルタイムに表示されるデータ ポイントを監視し、、プローブが (~ 3 分商工会議所にプローブを配置後) を安定化します。
4. 2 秒間隔で記録した測定値と 6 時間の継続的に O₂レベルを測定する「測定」をクリックします。
5. 測定を停止し、各サンプルを分析するための手順 4.1-5.4 を繰り返します。
6. クリックして、データを Microsoft Excel にエクスポート"ファイル |エクスポート |.Xls として保存"。

6. データの分析

1. OCR を計算します。
   1. エクスポートされた Excel ファイル"Within_Rates"タブの下でそれぞれの商工会議所の測定 (nmol/h)「率」を記録します。
   2. 各実験のサンプルでは、空白のチャンバー修正された OCR 値を取得するに実験試料室の「率」からの「率」を減算し、この数値の絶対値を取る。
   3. 質量使用携帯修正絶対 OCR 値で除算して寄主の mg 当たり合計 OCR を計算します。
   4. 平均は、各系統の"寄主の mg 当たり OCR"値をレプリケートします。
2. 適切な統計的手法を用いたデータ分析 (e.g。、スチューデントのt-テスト、分散分析) 他の統計ソフトウェアの Microsoft Excel を使用して。
3. 生データをグラフ化、グラフ化したい場合は、各時点の残存酸素の割合を計算します。単独で最初の読書を分割 (100% 酸素残存) 100 倍、各後続の読み取りの最初の読書、除算し、100 倍チャンバ内酸素の割合を取得します。

7. 冬発芽発芽の段階で寄主を分離するための誘導

1. バイオ セーフティ キャビネットのストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL) を添加した PDB (24 g/L) を準備します。
2. 1.5 mL 遠心チューブに米国アルテリシジン寄主の約 10 mg を配置します。
3. PDB の 500 μ L で、寄主を中断します。優しくピペット培地で寄主の塊がなくなるまで混ぜます。
4. 冬サスペンションを含む PDB ストレプトマイシン硫酸塩を添加したオートクレーブ 250 mL 三角フラスコに転送します。
5. 一晩で 28 ° C 90 rpm で振動フラスコを孵化させなさい。

8. シャーレおよびマイクロマニピュレーターの準備

1. マイクロキャピ ラリーの準備、およびサンプル コレクションの液滴行数のピペッティングしてシャーレ (57 cm²) を準備します。
   1. ペトリ皿の上部に 5 μ L (x 4) dH₂O 液滴をピペットします。
   2. 2 μ L (x3) サンプル コレクションに使用するシャーレに RNA 安定化溶液をピペットします。
   3. ペトリ皿に寄主を発芽 5 (30) x μ L 水滴をピペットします。
2. 鉱物油の 15 mL をシャーレに追加します。すべての液滴が進む前に油で覆われていることを確認します。
3. マイクロキャピ ラリー ホルダーにそれを置き、鉱物油に水没して毛細管は、マイクロキャピ ラリーを入力する鉱物油になります 15 μ m の内径、1 mm フランジ、55 ミリメートルの長さ、20 ° の先端角とマイクロキャピ ラリーを準備します。水液滴に持ち込む前に、マイクロキャピ ラリー内の圧力のリリースです。吸引水でマイクロキャピ ラリーを準備します。

9. ステージ固有の発芽の寄主の分離

1. 発芽粒のいずれかに準備マイクロキャピ ラリーを移動マニピュレーターのコントロールを使用する。液滴を浸透、マイクロキャピ ラリーを下げ、関心の発芽の段階で発芽冬までマイクロキャピ ラリーの口をもたらします。
2. ゆっくりと発芽の冬をキャプチャする吸引します。一度、冬を迎えて、マイクロキャピ ラリーを吸引を停止します。繰り返して、マイクロキャピ ラリーを約 5 寄主があります。
3. マニピュレーターにマイクロキャピ ラリーを上げるし、RNA 安定化ソリューションのコレクション液滴にそれをもたらします。液滴を浸透し、寄主の液滴を注入します。
4. 約 1,000 の寄主がキャプチャされるまで 8.1 に 8.3 の手順を繰り返します。

10 コレクション液滴の回収

1. コレクション液滴をピペットし、RNase 空き DNase の 2.0 mL 遠心チューブの蓋に転送。コレクション液滴を乱すことがなく、ピペットと鉱物油を慎重に取り外します。
2. RNA の隔離など下流用、寄主を使用します。

結果

休眠寄主が呼吸 (1,075 ~ µmol/h/mg) 発芽と比較しての低レベルを示すことを確認した冬の休眠および発芽における呼吸速度の変化を測定するクラーク型 microrespirometer ベース メソッドを使用して、寄主 (2,614 ~ µmol/h/mg;図 1 a)。これは、休眠寄主と発芽を誘導されて寄主の呼吸率は平均で ~2.4-fold 変更を表します。さらに、発芽に誘導されている寄主酸...

ディスカッション

担子菌赤植物病原菌は、毎年作物の損失の数十億ドルを引き起こします。これらの病原体の大半は、真菌の散布と有性生殖に不可欠な寄主を生成します。寄主の発芽と開発の知識を得ることは、これらの菌によって引き起こされる破壊的な病気の広がりを理解する重要です。主な制御点で分子の変更を識別するために我々 は、生理学的変化と発芽の段階で寄主を分離する別のタイミングを識...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004