Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Resumo

Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.

Resumo

Fungos são os agentes etiológicos de várias doenças agrícolas devastadores. Eles são caracterizados pela produção de teliospores, que são agentes de dispersão de paredes grossas. Teliospores podem permanecer dormentes por décadas. A dormência é caracterizada por baixas taxas metabólicas, pausado biossíntese macromolecular e reduzido os níveis de respiração. Ao receber sinais ambientais necessários, teliospores germinam para produzir células haploides, que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação de teliospore caracteriza-se pela retomada de biossíntese macromolecular, aumento da respiração e dramáticas mudanças morfológicas. Para medir precisamente as alterações na respiração celular durante os estágios iniciais de germinação, nós desenvolvemos um protocolo simples, empregando um respirometer Clark-tipo. Os estagios de germinação são distinguidos por alterações morfológicas específicas, mas a germinação é assíncrona. Desenvolvemos uma técnica de microdissection que nos permitirá coletar teliospores em fases distintas de germinação.

Introdução

Os fungos (Ustilaginales) consistem em mais de 1.600 espécies que infectam de gramíneas, incluindo as importante cereais de milho, cevada e trigo, causando bilhões de dólares em perdas de safra anualmente¹. Estes fungos são caracterizados pela produção de teliospores, que tem sombriamente pigmentado paredes celulares e são os agentes de dispersão. Teliospores a função de proteger o material genético durante o stress da dispersão entre plantas hospedeiras e pode persistir em um estado dormente por anos². Como tal, teliospores são um componente essencial da propagação da doença.

A fim de estudar Biologia teliospore, nosso laboratório utiliza o fungo de obscenidade modelo Ustilago maydis (U. maydis), que é o agente causal da doença 'ferrugem comum do milho'. Maduras U. maydis teliospores caracterizam-se pela detenção de crescimento, metabolismo celular reduzido e baixos níveis de respiração celular³. Em condições ambientais favoráveis (ex., a presença de açúcares específicos), U. maydis teliospores germinar e completar basidiósporos meiose, produzindo que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação é caracterizada por aumento da respiração, a atividade de retorno para metabólica e a progressão por etapas morfológicas observáveis de germinação⁴.

A fase inicial de germinação inclui aumento da respiração e função metabólica, no entanto, não há morfológicos indícios de mudança. As originais de alteração respiratória em U. maydis foram efectuadas medições mais de 50 anos atrás, medição do consumo de oxigênio manometrically com um balão de Warburg aparelho⁵. Nós desenvolvemos um método de estudar alterações precisas na respiração durante a germinação de teliospore pela medição do consumo de oxigênio durante um tempo de germinação, usando um microrespirometer de Clark-tipo novo, simples. Anteriormente, usamos este método para estudar alterações na frequência respiratória entre o selvagem-tipo U. maydis células haploides e mutantes com mitocôndrias defeituosas⁶e adaptaram o protocolo aqui para estudar alterações na respiração teliospore durante germinação. Isso fornece um meio de identificar com precisão o momento da mudança de respiração para que nós pode direcionar teliospores no momento oportuno, após o início da germinação para investigar eventos moleculares precoce. A progressão de germinação pode ser seguida ao microscópio uma vez que o promycelia emerge o teliospore, mas a natureza assíncrona inibiu o isolamento de bastante teliospores em uma determinada fase para investigação. Desenvolvemos uma técnica de microdissection similar àqueles usados para fertilização in vitro para coletar fisicamente teliospores em distintas fases morfológicas da germinação.

Protocolo

1. infecção de espiga de milho

1. Crescer Zea mays (CV. Golden Bantam) até que as espigas são formadas e começaram a seda (aproximadamente 60 dias).
2. Cultura haploides compatíveis U. maydis cepas usando protocolos padrão como anteriormente descrito⁷.
3. Infectar as espigas de milho usando protocolos padrão, como descrito anteriormente,⁷.

2. teliospore colheita

1. Equipamento de autoclave (funil de Büchner, frascos de Büchner, liquidificadores, garrafas de 250 mL centrífuga, espátulas planas e água) usando um padrão seco ciclo com pelo menos 30 min esterilização a 121 ° C (ciclo líquido padrão para água).
2. Remova infectadas espigas de plantas (aproximadamente infecção de postagem de 28-35 dias) usando uma navalha e coloque as espigas em uma bandeja coberta de protetor de banco.
3. Remover os tumores de espigas com uma lâmina de barbear e recolher num copo.
4. Encher um copo de liquidificador de laboratório de 250 mL com tumores até aproximadamente 1/3 completo e adicionar autoclavado dH₂O até o copo do liquidificador é de aproximadamente 3/4 completo. Perturbar os tumores por pulsando o misturador no ponto baixo, até homogeneizado.
5. Conecte a bomba de vácuo para uma armadilha de água e em seguida para um balão de Büchner de 1 L.
6. Inserir o balão grande funil de Büchner e forre o fundo do funil de Büchner com quatro camadas de gaze.
7. Ligue a bomba de vácuo.
8. Despeje uma porção dos tumores homogeneizadas através da gaze de algodão e raspar com uma espátula.
9. Despeje algumas dH₂O pano a fim de liberar os teliospores através de.
10. Repita até o dH₂O passando a gaze é claro.
11. Torça o pano contendo o material homogeneizado tumor no filtro para garantir a recuperação máxima teliospore.
12. Quando o balão de Büchner 1L está ficando perto de cheio, esvazie-a em um Erlenmeyer de grande e reserve.
13. Colocar um novo pedaço de gaze no filtro e repita os passos (2.7-2.12) até que todos os tumores foram interrompidos e filtrados.
14. Despeje os teliospores filtradas em frascos de 250ml autoclavado centrífuga e centrifugar a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.
15. Repita a etapa 2.14 até todos os teliospores filtrados são peletizados por centrifugação.
16. Suspenda as bolinhas em uma pequena quantidade de água e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL.
17. Centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.
18. Suspender o pellet em aproximadamente 50 mL de dH₂O, centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante. Delicadamente raspe a camada superior cinza com uma espátula e deposite. Repita até que já não há uma camada de cinza por cima.
19. Seca as amostras durante a noite num exsicador de vácuo.
20. Loja teliospores secas a 4 ° C até o uso.
21. Se desejado, trate as teliospores com sulfato de cobre⁸ antes de induzir a germinar. Se não for tratada, em seguida, execute minuciosa análise microscópica dos teliospores para confirmar a amostra representa teliospores puras e é desprovida de bactérias ou outras contaminações.
    1. Pese cerca de 50 mg de teliospores em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    2. Adicione cerca de 1,0 mL de 0,75% CuSO₄ para o tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo os teliospores. Pipete para cima e para baixo suspender os teliospores da solução de CuSO₄ seguido de agitar a amostra durante 3 h.
    3. Centrifugar a amostra a 2.500 x g por 5 min e retire o sobrenadante. Resuspenda o pellet de teliospore com água estéril, repetir a centrifugação e remover o sobrenadante.
    4. Repita a etapa 2.21.3 mais duas vezes.

3. teliospore viabilidade e teste de germinação

1. Pese cerca de 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para avaliar sua viabilidade e o tempo de germinação.
2. Em uma armário de biossegurança, prepare batata dextrose caldo de carne (PDB, 24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL).
3. Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Delicadamente, pipete para misturar e quebrar todos os grupos de teliospores.
4. Transferi a suspensão de teliospore para um esterilizada 250ml balão de Erlenmeyer contendo 10 mL de APO.
5. Incube o frasco a 28 ° C, agitando a 90 rpm para 12-16 h.
6. Em uma armário de biossegurança, retire uma amostra de 20 µ l dos teliospores induzido a germinar e preparar uma lâmina de microscópio.
7. Usando um microscópio, visualmente avalie estágios de germinação que estão presentes e a presença de contaminação bacteriana.
   1. Contar o número de teliospores em encena através de V usando um hemocytometer e determinar a porcentagem que tem germinado.
   2. Se única fase I teliospores estão presentes, continuar a incubar o frasco para um total de 24 h antes de avaliar a germinação de teliospore. Continue a incubação por um período máximo de 48 h antes de considerar a amostra inviáveis.
   3. Se houver contaminação bacteriana, completar o PDB com sulfato de canamicina (50 µ g/mL) bem como sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e em seguida, repita as etapas de 3.1 a 3.7. Se persistir de contaminação bacteriana, tratar teliospores com sulfato de cobre e repita as etapas de 3.1 a 3.7.

4. indução da germinação para monitorização da respiração

1. Pesar a quantidade igual (ex., 50 mg) de teliospores para cada experiência de respiração.
2. Em uma armário de biossegurança, adicione teliospores para uma câmara de respiração autoclavados.
3. Encher a câmara com PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e sulfato de canamicina (50 µ g/mL).
4. Pipete para cima e para baixo para criar uma suspensão de teliospore.
5. Coloque a tampa de câmara na câmara para criar vedação hermética.

5. obtenção de medições de taxa (OCR) de consumo de oxigênio

1. Coloque a câmara no rack câmara dentro de um banho de água (pré-aquecido a 28 ° C).
2. Coloque a sonda de₂ O dentro da abertura da câmara.
3. Monitorar os pontos de dados em tempo real sobre o programa de "Taxa de SensorTrace" e deixar a sonda estabilizar (~ 3 min depois a sonda é colocada na câmara).
4. Clique em "Medida" para medir os níveis de₂ O continuamente por 6 h com medições gravadas em intervalos de 2 s.
5. Parar a medição e repita etapas 4.1 – 5.4 para cada amostra a ser analisada.
6. Exportar os dados para o Microsoft Excel, clicando em "arquivo | Exportação | Salve como. xls".

6. análise de dados

1. Calcular o OCR
   1. No arquivo Excel exportado sob a aba "Within_Rates", grave a "taxa" para cada medição de câmara (nmol/h).
   2. Para cada amostra experimental, subtrair a "taxa" da câmara em branco da "Taxa" da câmara de amostra experimental para obter um valor corrigido do OCR e o valor absoluto desse número.
   3. Calcule o total OCR por mg de teliospores, dividindo o valor corrigido de OCR absoluto pelo celular usado em massa.
   4. Média replicar valores "OCR por mg de teliospores" para todas as estirpes.
2. Analisar os dados usando o método estatístico apropriado (por exemplo., t do estudante-teste, análise de variância) usando o Microsoft Excel de outros softwares estatísticos.
3. Para o gráfico de dados brutos, calcular a porcentagem de oxigênio restante para cada ponto de tempo que você deseja gráfico. Dividir a primeira leitura por si só e multiplique por 100 (100% de oxigênio restante), depois dividir cada leitura subsequente pela primeira leitura e multiplicar por 100 para obter a porcentagem de oxigênio restante na câmara.

7. indução da germinação de Teliospore para isolar Teliospores em distintas fases de germinação

1. Prepare o PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) em um armário de biossegurança.
2. Coloque aproximadamente 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
3. Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Suavemente a pipeta para misturar até que haja sem grumos de teliospores no meio.
4. Transferi a suspensão de teliospore para um Erlenmeyer de 250ml esterilizado contendo PDB suplementado com sulfato de estreptomicina.
5. Incube o frasco durante a noite a 28 ° C, agitando a 90 rpm.

8. preparação da placa de Petri e micromanipulador

1. Prepare um prato de Petri (57 cm²) por linhas de pipetagem de gotículas para preparação da conta e coleta de amostra.
   1. Pipete 5 gotas de₂O de dH µ l (x 4) na parte superior da caixa de Petri.
   2. Pipete 2 µ l (x3) de solução de estabilização de RNA sobre o prato de Petri deve ser usado para coleta de amostra.
   3. Pipete 5 µ l (x 30) as gotas de germinação teliospores sobre o prato de Petri.
2. Adicione 15 mL de óleo mineral para o prato de petri. Certifique-se de que todas as gotas estão cobertas pelo óleo antes de prosseguir.
3. Prepare uma conta com um 15 µm de diâmetro interno, flange de 1 mm, 55 mm de comprimento e um ângulo de ponta de 20°, colocando-o no suporte de conta e submergindo no óleo mineral onde ação capilar permitirá que o óleo mineral entrar a conta. Libera a pressão na conta antes de trazê-lo para a gota de água. Aspirado para preparar a conta de água.

9. isolamento de estágio específico germinação Teliospores

1. Usando os controles do micromanipulador, mova a conta preparada para dentre as gotas de germinação. Penetrar o droplet, reduzir a conta e trazer a boca da conta até um teliospore de germinação na fase de germinação de interesse.
2. Lentamente, Aspire para capturar o teliospore de germinação. Pare por aspiração, uma vez que o teliospore entrou a conta. Repita até há cerca de cinco teliospores na conta.
3. Criar a conta com o micromanipulador e trazê-lo para a gota de coleção de solução de estabilização de RNA. Penetrar a gota e injetar os teliospores da gota.
4. Repita as etapas de 8.1 a 8.3 até aproximadamente 1.000 teliospores foram capturados.

10. recuperação de coleção da gota

1. Pipetar acima da gota de coleção e transferi-lo para a tampa de um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL RNase/DNase-livre. Remova cuidadosamente o óleo mineral com uma pipeta sem perturbar o droplet de coleção.
2. Use os teliospores para aplicações a jusante, tais como a isolação do RNA.

Resultados

Usando o método de Clark-tipo com base em microrespirometer de medir as mudanças na respiração durante a dormência teliospore e germinação, Confirmámos que dormente teliospores apresentam um baixo nível de respiração (~ 1.075 µmol/h/mg), comparado a germinação teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Isto representa uma mudança de ~2.4-fold em média taxa de respiração entre dormentes teliospores e teliospores que têm sido induzidos a ge...

Discussão

Patógenos de vegetais basidiomiceto biotrófica causam bilhões de dólares em perdas de safra anualmente. A grande maioria desses patógenos produzem teliospores que são parte integrantes de fungo dispersão e reprodução sexual. Ganhar o conhecimento do desenvolvimento e germinação de teliospores é fundamental para entender a propagação das doenças devastadoras causadas por estes fungos. A fim de identificar alterações moleculares em pontos chave controle criámos um método para identificar o momento de mud...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004