Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

Özet

Kurum mantarlar çok yıkıcı tarım hastalıkları neden. Yanıt olarak çevre ipuçları çimlenme uyuyan teliospores olarak dağılmış. Çimlenme sırasında moleküler değişiklikleri öğrenmek için iki yöntem anahat: metabolik aktivasyon algılamak için solunum artış ölçme ve moleküler olayları farklı morfolojik aşamalarında teliospores izole ederek değiştirme değerlendirilmesi.

Özet

Kurum mantarlar birkaç yıkıcı tarımsal hastalıkların etiyolojik ajanlar. Onlar teliospores, kalın duvarlı dağılma ajanlar üretim tarafından karakterizedir. Teliospores yıllardır atıl kalabilir. Uyuşukluk düşük metabolik oranları ile karakterize, makromoleküllerin biyosentezi durdu ve solunum düzeyde büyük ölçüde azalır. Gerekli çevre sinyalleri aldıktan sonra yeni mermi enfeksiyon başlatabilir haploit hücreleri üretmek için teliospores çimlenme. Teliospore çimlenme makromoleküllerin biyosentezi, artan solunum ve dramatik morfolojik değişiklikler yeniden başlamasını ile karakterizedir. Tam olarak çimlenme erken evrelerinde hücresel solunum değişiklikleri ölçmek için basit bir protokol Clark tipli respirometer istihdam geliştirdik. Çimlenme sonraki aşamalarını belirli morfolojik değişiklikler tarafından ayırt edilir ama çimlenme uyumsuzdur. Biz teliospores ayrı çimlenme aşamalarında toplamamızı sağlayan bir mikrodiseksiyon teknik geliştirilmiştir.

Giriş

Kurum mantarlar (Ustilaginales) önemli tahıl bitkileri, Mısır, arpa ve buğday da dahil olmak üzere, milyarlarca dolar kırpma kayıplara yol açan bitkiler enfekte 1,600 türler oluşur her yıl¹. Bu mantarlar hücre duvarları koyu pigmentli ve dağıtım aracıları olan teliospores, üretim ile karakterizedir. Teliospores ana bitkiler arasında yayılma stresleri sırasında genetik materyal korumak için çalışır ve yıl²için atıl bir durumda devam edebilir. Bu nedenle, teliospores hastalığı yaymak bir unsuru vardır.

Teliospore Biyoloji çalışma amacıyla modeli kurum mantar hastalığı 'ortak kurum Mısır' nedensel ajan olan Ustilago maydis (U. maydis), bizim laboratuvar yararlanmaktadır. U. maydis olgun teliospores büyüme tutuklama, azaltılmış hücre metabolizması ve hücresel solunum³düşük düzeyleri tarafından karakterizedir. Uygun çevre koşulları içinde (örn., özel şeker varlığı), U. maydis teliospores çimlenme ve tam yeni mermi enfeksiyon başlatabilir mayoz, üreten basidiospores. Çimlenme artan solunum, dönüş için metabolik aktivite ve çimlenme⁴gözlemlenebilir morfolojik aşamalarla ilerleme ile karakterizedir.

Çimlenme ilk aşamada artan solunum ve metabolik fonksiyon içerir, ancak, değişimin morfolojik bir belirti yok. U. maydis solunum değişikliği özgün ölçümleri üzerinden 50 yıl önce oksijen tüketimi manometrically Warburg şişesi aparatı⁵ile ölçüm yapılmıştır. Çimlenme Clark tipli microrespirometer kullanarak bir saat boyunca oksijen tüketimi ölçerek hassas solunum teliospore çimlenme sırasında değişimler okuyan yeni ve basit bir yöntem geliştirdik. Daha önce vahşi-türü arasında solunum hızı değişiklikleri incelemek için bu yöntem kullanılan U. maydis haploit hücreleri ve arızalı mitokondri⁶, mutantlarla ve protokol teliospore solunum sırasında değişiklikleri çalışmaya adapte olması çimlenme. Bu biz teliospores erken moleküler olayları araştırmak için çimlenme başlanmasından sonra uygun zamanda hedef böylece doğru solunum değişikliği zamanlama tanımlamak için bir yol sağlar. Çimlenme ilerlemesini mikroskobik bir kez promycelia teliospore ortaya çıkıyor ama yeterli teliospores yalıtım soruşturma için belirli bir aşamada zaman uyumsuz doğa inhibe izlenebilir. Biz o vitro fertilizasyon için fiziksel olarak farklı morfolojik çimlenme aşamalarında teliospores toplamak için kullanılan benzer bir mikrodiseksiyon teknik geliştirilmiştir.

Protokol

1. mısır koçanı enfeksiyon

1. Zea mays (cv. altın ufak tefek) büyümek kadar koçanı kurulur ve ipek (yaklaşık 60 gün) başlamıştır.
2. Kültür uyumlu haploit U. maydis daha önce standart protokolleri kullanarak suşları açıklanan⁷.
3. Yukarıda açıklanan⁷olarak standart protokolleri kullanarak mısır koçanı bulaştırmak.

2. teliospore hasat

1. Otoklav ekipman (Büchner huniler, Büchner şişeler, karıştırıcılar, 250 ml'lik santrifüj şişe, düz spatula ve su) bir standart kuru kullanarak döngüsü ile en az 30 dk sterilizasyon 121 ° c (Standart sıvı döngüsü su için).
2. Bir jilet kullanarak enfekte koçanı bitkilerden (yaklaşık 28-35 gün sonrası enfeksiyon) kaldırın ve tezgah koruyucu kaplı bir tepsi üzerinde koçanı ayarlayın.
3. Bir tıraş bıçağı ile koçanı tümörler kaldırmak ve bir ölçek içinde toplamak.
4. 250 mL laboratuvar blender Kupası tümörleri ile yaklaşık 1/3 tam kadar doldurun ve blender yaklaşık 3/4, bu kadar autoclaved dH₂O ekleyin tam. Tümörler homojenize oluncaya kadar düşük, blender darbe tarafından bozabilir.
5. Vakum Pompası Su tuzak ve sonra bir 1 L Büchner şişesi bağlayın.
6. Büyük Büchner huni şişeye yerleştirin ve Büchner huni dört kat tülbent ile alt çizgi.
7. Vakum pompası açmak.
8. Tülbent ve kazıma yoluyla homojenize tümörleri bir kısmını bir spatula ile dökün.
9. Bazı dH₂O teliospores aracılığıyla floş için tülbent dökün.
10. DH₂tekrar tülbent ile geliyor O açıktır.
11. Homojenize tümör materyal içeren en fazla teliospore kurtarma sağlamak için filtre içine tülbent dışarı sıkmak.
12. 1 L Büchner şişeye yakın alırken tam, büyük bir Erlenmeyer şişesi boşaltın ve bir kenara koyun.
13. Filtre içine tülbent yeni bir parça koy ve tüm tümörler bozulduğu ve filtre (2.7-2.12) tamamlayana dek.
14. Filtre uygulanmış teliospores autoclaved 250 ml'lik santrifüj şişe ve 5 min için 1000 x g, santrifüj içine dökün ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
15. Tüm filtre uygulanmış teliospores tarafından Santrifüjü pelleted kadar 2,14 tekrarlayın.
16. Granül küçük bir miktar su ve 50 mL santrifüj tüpleri transfer askıya.
17. 1000 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
18. Pelet askıya dH₂O yaklaşık 50 mL, 1000 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak. Yavaşça gri üst tabaka bir spatula ve bunu atmayın ile kazı. Üstte gri bir tabaka artık kadar yineleyin.
19. Kuru örnekleri bir vakum desiccator geceleme.
20. 4 ° C'de kurutulmuş teliospores kullanmak kadar saklamak.
21. İstenirse, teliospores Bakır sülfat⁸ ile çimlenme için inducing önce tedavi. Tedavi değil, örnek saf teliospores temsil eder ve bakteriyel veya diğer contaminations yoksun olduğunu onaylamak için teliospores ayrıntılı mikroskobik analizi gerçekleştirin.
    1. Yaklaşık 50 mg teliospores 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde dışarı tartın.
    2. Yaklaşık 1.0 mL % 0.75 CuSO₄ teliospores içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı teliospores 3 h için örnek Tantanacı tarafından takip CuSO₄ çözümde askıya almak için.
    3. 2500 x g 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Teliospore Pelet steril su ile resuspend, aralıklarla tekrarlayın ve süpernatant kaldırın.
    4. 2.21.3 iki kez daha tekrarlayın.

3. teliospore canlılığı ve çimlenme Test

1. U. maydis teliospores canlılığı değerlendirmek için 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde yaklaşık 10 mg ve çimlenme zamanlaması tartın.
2. Bir biyogüvenlik kabini, streptomisin sülfat (160 µg/mL) ile desteklenmiş patates dekstroz suyu (PDB, 24 g/L) hazırlayın.
3. Teliospores PDB 500 µL içinde askıya alma. Yavaşça karıştırın ve teliospores tüm kümeleri kadar kırmak için pipet.
4. Teliospore süspansiyon bir autoclaved 250 mL Erlenmeyer PDB 10 mL içeren flask aktarın.
5. 12-16 h için 90 rpm'de sallayarak 28 ° C'de şişeye kuluçkaya.
6. Bir biyogüvenlik kabini, çimlenme ve mikroskop slayt hazırlamak için indüklenen teliospores 20 µL örneğini kaldırın.
7. Bir mikroskop kullanarak, görsel olarak mevcut çimlenme aşamaları ve bakteriyel kontaminasyon varlığı değerlendirmek.
   1. Teliospores saymak sahneler bir hemasitometre kullanarak V ile ve germinated yüzde belirlemek.
   2. Eğer sadece evre ı teliospores mevcut, teliospore çimlenme değerlendirilmesi önce 24 saat olmak üzere toplam şişeye kuluçkaya devam. Örnek uygun olmayan deeming önce kuluçka en fazla 48 h devam.
   3. Bakteriyel kirlenme varsa, sefaloridin sülfat (50 µg/mL) ile PDB streptomisin sülfat (160 µg/mL) yanı sıra ek ve adımları 3.1 3,7 için yineleyin. Bakteriyel kontaminasyon ederse, teliospores Bakır sülfat ile tedavi ve 3.1 3,7 olan adımları yineleyin.

4. solunum izleme çimlenme indüksiyon

1. Eşit miktarda tartmak (örn., 50 mg), her solunum deney için teliospores.
2. Bir biyogüvenlik kabini, teliospores bir autoclaved solunum odasına ekleyin.
3. Dolgu PDB (24 g/L) ile odası streptomisin sülfat (160 µg/mL) ve sefaloridin sülfat (50 µg/mL) ile desteklenmiştir.
4. Yukarı ve aşağı bir teliospore süspansiyon oluşturmak için pipet.
5. Odası kapak hava sıkı mühür oluşturmak için odasına koyun.

5. oksijen tüketim hızı (OCR) ölçümleri elde etme

1. Odası (28 ° C'ye ısıtılmış) bir su banyosu içinde odası raf yerleştirin.
2. O₂ soruşturma açılması odasının içinde bir yer.
3. Gerçek zamanlı "SensorTrace oranı" programı olarak görünen veri noktaları izlemek ve (~ 3 sonda odasında yerleştirildikten sonra min) stabilize etmek sonda izin.
4. "2 s aralıklarla kaydedilen ölçümleri ile 6 h için sürekli olarak O₂ düzeylerini ölçmek için ölçü birimi"'ı tıklatın.
5. Ölçüm durdurmak ve adımları 4.1-5,4 analiz edilecek her örnek için yineleyin.
6. Tıklatarak verileri Microsoft Excel'e ver "dosya | İhracat | «««Kaydet".xls.

6. veri analizi

1. OCR hesaplamak
   1. "Within_Rates" sekmesi altında verilen Excel dosyasında "Oranı" her odası ölçüm (nmol/h) için kayıt.
   2. Deneysel her örnek için "Düzeltilmiş bir OCR değer elde etmek için oranı" deneysel örnek odası boş odasından "oranı" çıkarmak ve bu sayının mutlak değerini alır.
   3. Teliospores mg başına toplam OCR kitle kullanılan cep tarafından düzeltilen mutlak OCR değer bölerek hesaplayın.
   4. Ortalama her zorlanma "OCR teliospores mg başına" değerlerini çoğaltmak.
2. Uygun istatistiksel yöntem kullanarak verileri analiz (e.g., öğrenci t-testi, Varyans analizi) Microsoft Excel diğer istatistiksel yazılım kullanarak.
3. Ham veri grafiği, grafik istediğiniz her zaman-nokta için kalan oksijen yüzdesi hesaplamak için. İlk okuma kendisi tarafından bölmek ve (% 100 oksijen kalan) 100 ile çarpmak, sonra sonraki her okuma tarafından ilk okuma bölmek ve oksijen odasında kalan yüzde elde etmek için 100 ile çarpmak.

7. indüksiyon Teliospores çimlenme farklı aşamalarında yalıtmak için Teliospore çimlenme

1. Streptomisin sülfat (160 µg/mL) bir biyogüvenlik kabini ile takıma PDB (24 g/L) hazırlayın.
2. Yaklaşık 10 mg U. maydis teliospores 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin.
3. Teliospores PDB 500 µL içinde askıya alma. Yavaşça pipet teliospores orta hiçbir kümeleri kadar karıştırın.
4. Teliospore süspansiyon streptomisin sülfat ile desteklenmiş PDB içeren bir autoclaved 250 mL Erlenmeyer flask aktarın.
5. Gecede 28 ° C'de 90 rpm'de sallayarak şişeye kuluçkaya.

8. Petri kabına ve Micromanipulator hazırlanması

1. Petri kabına (57 cm²) damlacıkları pipetting satırlara göre microcapillary hazırlık ve örnek koleksiyon için hazırlayın.
   1. 5 (x 4) µL dH₂O damlacıkları Petri kabına üst boyunca pipet.
   2. 2 µL (x3) RNA sabitleme çözüm üzerinde örnek koleksiyon için kullanılmak üzere Petri kabına pipet.
   3. Petri kabına teliospores takımıdır, 5 (x 30) µL damlacıkları pipet.
2. Mineral yağı 15 mL petri kabına ekleyin. Bütün damlacıklar petrol devam etmeden önce kapalı olduğunu emin olun.
3. Bir microcapillary 15 µm iç çapı, 1 mm flanş, 55 mm Uzunluk ve 20 ° uç açısı içinde microcapillary sahibinin yerleştirerek ve mineral yağ nerede kılcal eylem madeni yağ microcapillary girmek izin verir batış hazırlayın. Yayın microcapillary basınç su damlacığı getirmeden önce. Su ile microcapillary hazırlamak için Aspire edin.

9. aşama özel takımıdır Teliospores yalıtım

1. Micromanipulator denetimleri kullanarak, hazırlanan microcapillary çimlenme damlacıkları birine taşıyın. Damlacık nüfuz eder, microcapillary alt ve microcapillary bir germinating teliospore kadar ağız çimlenme ilgi aşamasında.
2. Yavaş yavaş germinating teliospore yakalamak için Aspire edin. Teliospore microcapillary girdiğinde alıyorum durdurmak. Microcapillary içinde yaklaşık beş teliospores kadar yineleyin.
3. Micromanipulator ile microcapillary raise ve RNA sabitleme çözüm koleksiyonu damlacık getirmek. Damlacık nüfuz ve damlacık teliospores enjekte.
4. Yaklaşık 1000 teliospores yakalanan 8.1-8.3 tamamlayana dek.

10. toplama damlacık kurtarılması

1. Koleksiyon damlacık kadar pipet ve bir RNase/Dnaz-Alerjik 2.0 mL microcentrifuge tüp kapağı için transfer. Dikkatli bir şekilde bir pipet ile madeni yağ toplama damlacık bozmadan çıkarın.
2. Teliospores RNA izolasyon gibi aşağı akım uygulamaları için kullanın.

Sonuçlar

Solunum teliospore uyuşukluk ve çimlenme sırasında değişiklikleri ölçme Clark tipli microrespirometer tabanlı yöntem kullanarak, biz uyuyan teliospores takımıdır için karşılaştırıldığında solunum (~ 1,075 µmol/h/mg) düşük düzeyde sergi doğruladı teliospores (~ 2,614 µmol/h/mg; Şekil 1A). Bu ortalama oranı solunum uyuyan teliospores ve çimlenme için indüklenen teliospores arasında bir ~2.4-fold değişiklik gösterir. Buna e...

Tartışmalar

Basidiomycete biotrophic bitki patojenleri milyarlarca dolar her yıl ürün kayıplara neden. Bu patojenler büyük çoğunluğu mantar dağılma ve Eşeyli üreme için ayrılmaz teliospores üretmek. Bilgi geliştirme ve teliospores çimlenme kazanıyor bu mantarlar tarafından neden yıkıcı hastalıkların yayılması anlamak için önemlidir. Anahtar kontrol noktalarında moleküler değişiklikleri tanımlamak için fizyolojik vardiya ve teliospores çimlenme farklı aşamalarında yalıtmak için başka bir zama...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004