Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

요약

Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

초록

흑 수병 균은 여러 가지 파괴적인 농업 질병의 etiological 대리인. 그들은 두꺼운 분산 에이전트는 teliospores의 생산에 의해 특징은. Teliospores는 수십 년 동안 휴면 유지 수 있습니다. 휴면 낮은 신진 대사 속도 의해 특징 이다, 생 합성 고분자를 일시 중지 하 고 호흡의 레벨을 크게 감소. 필요한 환경 신호를 받으면 teliospores 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 단일 셀을 생산 하는 출 아 할. Teliospore 발 아 생 합성 고분자, 증가 한 호흡 및 극적인 형태 변화의 재개에 의해 특징입니다. 발 아의 초기 단계에서 세포 호흡에 변화를 정확 하 게 측정 하기 위해 간단한 프로토콜 클라크-유형 respirometer 고용 개발 했습니다. 발 아의 나중 단계 특정 형태학 상 변화에 의해 구별 된다 하지만 발은 비동기. 우리는 뚜렷한 발 아 단계에서 teliospores를 수집 수 서 기술 개발.

서문

Smut 버섯 (Ustilaginales) 잔디, 옥수수, 보 리, 밀의 중요 한 곡물을 포함 한 작물 손실에 수십억 달러를 일으키는 감염 1600 이상의 종 이루어져 매년¹. 이 균 류는 세포 벽을 착 음울는 분산 에이전트는 teliospores의 생산 특징입니다. Teliospores는 호스트 식물 사이의 분산의 스트레스 중 유전 물질을 방패로 작동 하 고 년²에 대 한 휴면 상태에 유지할 수 있습니다. 따라서, teliospores는 질병 확산의 필수적인 구성 요소.

Teliospore 생물학을 공부 하기 위하여 우리의 실험실 모델 smut 균을 Ustilago maydis (미국 maydis)은 '옥수수의 일반적인 검 댕' 질병의 인과 대리인을 이용 한다. 성숙한 미국 maydis teliospores 성장 검거, 감소 된 세포 물질 대사, 세포 호흡³의 낮은 수준에 의해 특징입니다. 유리한 환경 조건에서 (예., 특정 설탕의 존재), 미국 maydis teliospores 발 아 하 고 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 감수 분열, 생산 basidiospores 완료. 발은 증가 한 호흡, 대사를 반환 활동 및 발 아⁴의 현저한 형태학 단계를 통해 진행이 특징 이다.

그러나 증가 한 호흡 및 대사 기능을 포함 하는 발 아 초기 단계,, 변화의 형태학 표시가 없습니다. 원래 미국 maydis 에 호흡 변화 측정 50 년 전, 바르 부르 크 플라스 크 장치⁵와 manometrically 산소 소비량 측정 실행 되었다. 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 발 아의 시간 과정을 통해 산소 소비량을 측정 하 여 호흡 teliospore 발 아 동안에 정확한 변화를 공부 하 고 새로운, 간단한 방법을 개발 했습니다. 우리는 이전 야생-타입 사이의 호흡 속도에 변화를 공부 하이 메서드를 사용 미국 maydis 단일 세포 및 결함이 있는 미토 콘 드리 아⁶, 돌연변이가지고 여기에 프로토콜 teliospore 호흡 동안에 변화를 공부 하 발 아입니다. 이 우리가 발 아 초기 분자 이벤트 조사 개시 후 적절 한 시기에 teliospores을 타겟팅 할 수 있도록 호흡의 타이밍을 정확 하 게 식별 하는 수단을 제공 합니다. 일단은 promycelia, teliospore에서 나온다 하지만 비동기 자연 조사에 대 한 특정된 단계에서 충분 한 teliospores의 절연을 저해 발 아의 진행을 현미경으로 다음 수 있습니다. 우리는 비슷한 물리적으로 발 아의 고유한 형태소 단계에서 teliospores 수집을 체 외에서 수정에 사용 되는 기정 기법 개발.

프로토콜

1. 옥수수 옥수수 속 감염

1. 지 시 메이 스 (cv. 골든 자그마한) 성장까지 cobs 형성 되 고 실크 (약 60 일)를 시작 했습니다.
2. 호환 단일 미국 maydis 문화 긴장 이전 표준 프로토콜을 사용 하 여 설명⁷.
3. 앞에서 설명한⁷표준 프로토콜을 사용 하 여 옥수수 cobs 감염.

2. teliospore 수확

1. 고압 장비 (Büchner 퍼 널, Büchner 플라스 크, blenders, 250 mL 원심 분리기, 편평한 주걱, 병과 물) 표준 건조를 사용 하 여 적어도 30 분 살 균 121 ° C (물에 대 한 표준 액체 주기)에 주기.
2. 감염 된 속 식물 (약 28 ~ 35 일 게시 감염)에서 면도칼을 사용 하 여 제거 하 고 벤치 보호자에 덮여 쟁반에는 속 설정.
3. 면도날으로 속에서 있는 종양을 제거 하 고 비 커에서 수집.
4. 250 mL 실험실 믹서 기 컵 종양으로 약 1/3 전체 때까지 믹서 컵은 약 3/4까지 압력가 dH₂O 추가 전체. 무 균 때까지 낮은, 믹서 기를 펄스는 종양을 방해.
5. 물 함정 그리고 1 L Büchner 플라스 크 진공 펌프를 연결 합니다.
6. 플라스 크에 큰 Büchner 퍼 널을 삽입 하 고 투박한 무명의 4 개의 층을 가진 Büchner 퍼 널의 바닥을 일렬로 세우십시오.
7. 진공 펌프를 켭니다.
8. 주걱으로 투박한 부스러기를 통해 무 균된 종양의 일부를 부 어.
9. 일부 dH₂O을 통해 teliospores를 플러시 순서는 투박한 무명에 붓으십시오.
10. DH₂까지 반복 O는 투박한 무명을 통해 분명 하다.
11. 최대 teliospore 복구 되도록 필터에 무 균된 종양 물자를 포함 하는 투박한 아웃 찰 짜 십시오.
12. 1 L Büchner 플라스 크에 가까운 지 고 완전 한, 큰 삼각 플라스 크에 빈 고 따로 설정.
13. 투박한 무명의 새로운 조각을 필터에 넣고를 반복 (2.7-2.12) 단계는 종양의 모든 중단 하 고 필터링.
14. 압력가 250 mL 원심 병 및 5 분, 1000 x g에서 원심 분리기로 필터링 된 teliospores를 부 어 하 고는 상쾌한 가만히 따르다.
15. 모든 필터링 된 teliospores는 수송과 원심 분리에 의해 때까지 2.14 단계를 반복 합니다.
16. 적은 양의 물과 전송 50 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
17. 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.
18. DH₂O의 약 50 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고, 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심는 상쾌한 가만히 따르다. 부드럽게 주걱와 그것의 dispose 회색 상위 레이어를 다쳤어요. 위에 회색 레이어는 더 이상 때까지 반복 합니다.
19. 건조는 샘플 진공 desiccator에서 하룻밤.
20. 사용 될 때까지 4 ° C에서 건조 teliospores를 저장 합니다.
21. 원하는 경우, 발 아를 유도 하기 전에 구리 황산 염⁸ teliospores을 취급 합니다. 치료 하지 않으면 다음 샘플 순수 teliospores 나타내고 박테리아 또는 다른 오염 없는 것인지 teliospores의 철저 한 현미경 분석을 수행 합니다.
    1. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 teliospores의 대략 50 밀리 그램을 무게.
    2. 포함 하는 teliospores 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 0.75% CuSO₄ 의 약 1.0 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 3 h에 대 한 샘플 교 반 이어서 CuSO₄ 솔루션에는 teliospores를 일시 중단 하는 플라스틱.
    3. 5 분 동안 2500 x g에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend 살 균 물 teliospore 펠 릿, 원심 분리, 반복 하 고는 상쾌한 제거.
    4. 단계 2.21.3 두 번 더 반복 합니다.

3. teliospore 생존 능력 및 발 아 시험

1. 그들의 생존 능력을 평가 하는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 발 아의 타이밍 무게.
2. Biosafety 내각에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보충 감자 포도 당 국물 (PDB, 24 g/L)를 준비 합니다.
3. PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 teliospores의 모든 덩어리 헤어 플라스틱.
4. Teliospore 정지 압력가 250 mL 삼각 플라스 크는 PDB의 10 mL를 포함 전송.
5. 28 ° c 12-16 h 90 rpm 동요 플라스 크를 품 어.
6. Biosafety 내각에서 발 아 하 고 현미경 슬라이드를 준비 하도록 유도 하는 teliospores의 20 µ L 샘플을 제거 합니다.
7. 존재 하는 발 아의 단계 및 세균 오염 물질의 존재를 평가 시각적으로 현미경을 사용 하 여.
   1. teliospores의 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 V를 통해 나의 단계와 출 아 했다가지고 % 결정.
   2. 경우에 단계 I teliospores는, teliospore 발 아를 평가 하기 전에 24 시간 총 플라스 크를 품 어 계속. 샘플을 실행 가능한 비 deeming 전에 최대 48 h에 대 한 보육을 계속 합니다.
   3. 세균성 오염 있으면 스 황산 (160 µ g/mL) 뿐만 아니라 대 황산 (50 µ g/mL)와 PDB를 보충 하 고 단계 3.1 3.7 반복. 세균 오염 계속 되 면 황산 구리와 teliospores를 치료 하 고 단계 3.1 3.7를 반복 합니다.

4입니다. 호흡 모니터링에 대 한 발 아의 유도

1. 동일한 금액을 무게 (예., 50 mg) 각 호흡 실험에 대 한 teliospores의.
2. Biosafety 내각에 압력가 호흡 약 실에 teliospores을 추가 합니다.
3. 채우기 PDB (24 g/L)와 챔버 스 황산 (160 µ g/mL)과 대 (50 µ g/mL)와 보충.
4. 아래로 teliospore 정지를 만드는 플라스틱.
5. 공기가 꽉 인감을 만들려고 챔버 챔버 뚜껑을 놓습니다.

5. 산소 소비 속도 (OCR) 측정을 얻기

1. 물 목욕 (28 ° C에 미리 데워) 내부 챔버 선반에 챔버를 놓습니다.
2. O₂ 프로브는 챔버의 개통 안에 놓습니다.
3. "SensorTrace 속도" 프로그램에 실시간으로에서 표시 하는 데이터 요소를 모니터링 하 고 프로브 (~ 3 분 후 프로브는 챔버에 배치 됩니다)을 안정화 하자.
4. O₂ 수준을 지속적으로 6 h 2 s 간격 기록 측정 측정을 "측정"을 클릭 합니다.
5. 측정을 중지 하 고 각 샘플 분석을 위해 단계 4.1-5.4 반복 합니다.
6. 클릭 하 여 Microsoft Excel로 데이터를 내보내기 "파일 | 수출 | .Xls로 저장 "합니다.

6. 데이터 분석

1. OCR을 계산
   1. "Within_Rates" 탭에서 내보낸된 Excel 파일에서 각 챔버 측정 (nmol/h)에 대 한 "속도"를 기록 합니다.
   2. 각 실험 샘플에 대 한 수정 된 OCR 값을 얻기 위해 실험 시료 챔버의 "속도"에서 빈 챔버의 "속도"를 빼기 고이 숫자의 절대 값.
   3. Teliospores의 밀리 그램 당 총 OCR 대량 사용 하는 휴대 하 여 수정 된 절대 OCR 값을 나누어 계산 합니다.
   4. 평균 각 변형에 대 한 "teliospores의 밀리 그램 당 OCR" 값을 복제 합니다.
2. 적절 한 통계적 방법을 사용 하 여 데이터를 분석 (예., 스튜던트 t-검정, 분산 분석) 다른 통계 소프트웨어의 Microsoft Excel을 사용 하 여.
3. 원시 데이터를 그래프, 그래프 하고자 하는 각 시간 점에 대 한 남아 있는 산소의 비율을 계산. 자체에 나누어 첫 번째 읽기 (100% 산소 남은) 100을 곱하면, 다음 첫 번째 독서에 나누어 각 후속 읽기 그리고 산소 챔버에 남아 %를 100을 곱하십시오.

7. Teliospore 발 아 발 아의 다른 단계에서 Teliospores을 유도

1. PDB (24 g/L) biosafety 캐비닛에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보완을 준비 합니다.
2. 1.5 mL microcentrifuge 관으로 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 놓습니다.
3. PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 매체에 teliospores의 아무 덩어리까지 피 펫.
4. Teliospore 서 스 펜 션 스 황산으로 보충 하는 PDB를 포함 하는 압력가 250 mL 삼각 플라스 크에 전송.
5. 90 rpm에서 떨고 28 ° C에서 하룻밤 플라스 크를 품 어.

8입니다. 페 트리 접시 및 Micromanipulator 준비

1. Microcapillary 준비 및 샘플 컬렉션에 대 한 방울의 pipetting 행 페 트리 접시 (57 c m²)를 준비 합니다.
   1. 페 트리 접시의 위쪽에 5 µ L (x 4) dH₂O 방울 플라스틱.
   2. 샘플 컬렉션에 사용할 페 트리 접시에 RNA 안정화 솔루션의 2 µ L (x3) 플라스틱
   3. 페 트리 접시에 teliospores 출의 5 µ L (x 30) 물방울 플라스틱
2. 페 트리 접시에 미네랄 오일 15 mL를 추가 합니다. 모든 방울 진행 하기 전에 기름에 의해 보호 됩니다 확인 하십시오.
3. 15 µ m 내부 직경, 1 mm 플랜지, 55 m m 길이와 각도 20 ° 팁 microcapillary microcapillary 홀더에 그것을 배치 하 고 미네랄 오일에 모 세관 작용 광 유는 microcapillary를 입력 하면 그것을 물속으로 준비 합니다. 물 방울을 가져오기 전에 microcapillary에서 압력을 릴리스 합니다. 준비 물으로 microcapillary 발음.

9. 단계-특정 출 Teliospores의 격리

1. micromanipulator의 컨트롤을 사용 하 여 이동 준비 microcapillary 발 아 방울 중 하나. 작은 물방울을 관통 하 고 microcapillary, 낮은 관심의 발 아 단계에서 germinating teliospore까지 microcapillary의 입을 가져다.
2. 천천히 발음 germinating teliospore 캡처. 발음은 teliospore에서 microcapillary를 입력 했습니다 일단 중지 합니다. 약 5 teliospores는 microcapillary에 도착할 때까지 반복 합니다.
3. micromanipulator와 microcapillary를 RNA 안정화 솔루션의 컬렉션 방울을가지고. 드롭릿에 관통 하 고는 작은 물방울에는 teliospores를 주입.
4. 8.1 8.3 단계를 반복 하 여 약 1000 teliospores 체포 되었습니다.

10입니다. 컬렉션 물방울의 복구

1. 컬렉션 물방울을 pipette 고는 RNase/DNase 무료 2.0 mL microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 전송. 조심 스럽게 컬렉션 물방울을 방해 하지 않고 한 피 펫과 미네랄 오일 제거.
2. teliospores를 사용 하 여 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.

결과

우리는 휴면 teliospores 전시 호흡 (~ 1075 µ / h/mg) 출에 비해 낮은 수준 확인 teliospore 휴면 및 발 아 동안 호흡에 변화를 측정의 클라크-유형 microrespirometer 기반 방법을 사용 하 여, teliospores (~ 2,614 µ / h/mg; 그림 1A)입니다. 이 휴면 teliospores와 teliospores 발 아를 유도 하는 호흡의 평균 속도 ~2.4-fold 변화를 나타냅니다. 또한, 우리는 발 아를 유도 하는 teliospores...

토론

담 biotrophic 식물 병원 균을 일으킬 작물 손실에 수십억 달러의 매년. 이러한 병원 균의 대부분 곰 팡이 분산 및 유성 생식에 통합 되는 teliospores 생산. 개발의 지식과 teliospores의 발 아를 확보 하는 것이 이러한 곰 팡이로 인 한 치명적인 질병의 확산을 이해 중요 합니다. 주요 제어 지점에서 분자 변화를 파악 하기 위해 우리 생리 적 변화와 발 아의 다른 단계에서 teliospores을 다른의 타이밍을 식별 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004