Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

Résumé

Champignons du charbon causent de nombreuses maladies agricoles dévastateurs. Ils sont dispersés sous forme de téleutospores dormants qui germent en réponse à des stimuli environnementaux. Nous décrivons deux méthodes pour étudier les changements moléculaires au cours de la germination : augmentation de la respiration pour détecter l’activation métabolique de mesure et l’évaluation changeant des événements moléculaires en isolant les téleutospores aux stades morphologiques distincts.

Résumé

Champignons du charbon sont les agents étiologiques de plusieurs maladies agricoles dévastateurs. Ils sont caractérisés par la production de téleutospores, qui sont des agents de dispersion à parois épaisses. Téliospores peuvent rester dormants pendant des décennies. La dormance est caractérisée par faibles taux métaboliques, suspendu la biosynthèse macromoléculaire et grandement réduit les niveaux de la respiration. À la réception des signaux environnementaux requis, téleutospores germent pour produire des cellules haploïdes, qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination des téliospores se caractérise par la reprise de biosynthèse macromoléculaire, une augmentation de la respiration et remaniements morphologiques. Afin de mesurer avec précision les changements dans la respiration cellulaire durant les premiers stades de la germination, nous avons développé un protocole simple utilisant un respiromètre Clark-type. Les derniers stades de la germination sont distinguent par des changements morphologiques spécifiques, mais la germination est asynchrone. Nous avons développé une technique de microdissection qui nous permet de recueillir des téliospores aux stades de germination distinctes.

Introduction

Les champignons du charbon (Ustilaginales) se composent de plus de 1600 espèces qui infectent les herbes dont les récoltes de céréale importante de maïs, l’orge et le blé, causant des milliards de dollars en pertes de récoltes par an¹. Ces champignons sont caractérisés par la production de téleutospores, ont pigmenté sombrement les parois cellulaires, qui sont les agents de dispersion. Téliospores servent à protéger le matériel génétique au cours du stress de la dispersion entre les plantes hôtes et peuvent persister dans un état dormant pour les années². Par conséquent, téleutospores sont une composante essentielle de la propagation de la maladie.

Afin d’étudier la biologie téliospores, notre laboratoire utilise le champignon de charbon modèle Ustilago maydis (U. maydis), qui est l’agent causal de la maladie « charbon commun du maïs ». Mature U. maydis téliospores sont caractérisent par l’arrêt de croissance, le métabolisme cellulaire réduit et faible niveau de la respiration cellulaire³. Dans les conditions environnementales favorables (par exemple., la présence de sucres spécifiques), U. maydis téleutospores germent et toutes les basidiospores de la méiose, production qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination est caractérisée par une augmentation de la respiration, l’activité Retour à métabolique et la progression à travers les stades morphologiques observables de germination⁴.

La première étape de germination comprend une augmentation de la respiration et de la fonction métabolique, cependant, il n’y a pas d’indications morphologiques du changement. La taille originale du changement respiratoire dans U. maydis ont été effectuées depuis plus de 50 ans, mesurant la consommation d’oxygène manométriquement avec Warburg fiole appareil⁵. Nous avons développé une méthode simple d’étudier les changements précis dans la respiration durant la germination des téliospores en mesurant la consommation d’oxygène pendant un cours temps de germination à l’aide d’un microrespirometer de type Clark. Nous avons déjà utilisé cette méthode pour étudier les changements de rythme respiratoire entre le type sauvage mutants avec⁶de mitochondries défectueuses et U. maydis cellules haploïdes et ont adapté le protocole ici pour étudier les changements dans la respiration téliospores durant germination. Ceci fournit un moyen d’identifier avec précision le moment du changement de la respiration pour que nous puissions cibler téliospores le moment venu, après le début de la germination pour étudier les événements moléculaires précoces. La progression de la germination peut être suivie au microscope une fois le promycélium émerge de la téliospore, mais la nature asynchrone a inhibé l’isolement d’assez téleutospores à un stade donné pour enquête. Nous avons développé une technique de microdissection semblable à ceux utilisés pour la fécondation in vitro pour recueillir des téliospores physiquement à des stades morphologiques distincts de la germination.

Protocole

1. corn Cob Infection

1. Zea mays (CV Golden Bantam) de croître jusqu'à ce que les épis sont formés et ont commencé à la soie (environ 60 jours).
2. La culture haploïdes compatibles U. maydis souches à l’aide de protocoles standard comme précédemment décrit⁷.
3. Infecter les épis de maïs à l’aide de protocoles standard comme décrit précédemment⁷.

2. téliospores récolte

1. Équipement d’autoclave (entonnoir Büchner, flacons de Büchner, mélangeurs, bouteilles de 250 mL Centrifugeuse, spatules plates et eau) en utilisant une norme sec cycle au moins 30 min de stérilisation à 121 ° C (cycle liquide standard pour l’eau).
2. Enlever les épis infectés provenant de plantes (environ 28 à 35 jours après l’infection) à l’aide d’un rasoir et mettre les épis sur un plateau couvert de protecteur de banc.
3. Retirer les tumeurs épis avec une lame de rasoir et de recueillir dans un bécher.
4. Remplissez une tasse 250 mL de mélangeur laboratoire présentant des tumeurs jusqu'à environ 1/3 plein et ajoutez autoclavés dH₂O jusqu'à ce que la Coupe du mélangeur est environ 3/4 plein. Perturber les tumeurs petites pressions sur le mélangeur à faible, jusqu'à ce que homogénéisé.
5. Branchez la pompe à vide sur un piège à eau, puis dans une fiole de Büchner de 1 L.
6. Insérez le grand entonnoir Büchner dans la fiole et Tapissez le fond de l’entonnoir Büchner avec quatre couches d’étamine.
7. Tourner sur la pompe à vide.
8. Verser une partie des tumeurs homogénéisés par le biais de l’étamine et gratter avec une spatule.
9. Versez quelques dH₂O dans l’étamine afin de rincer les téliospores à travers.
10. Répétez jusqu'à ce que la dH₂O traversant l’étamine est clair.
11. Essorez l’étamine contenant le matériel de tumeur homogénéisé dans le filtre pour assurer un recouvrement maximal téliospores.
12. Quand le flacon de Büchner 1 L devient proche de plein, vider dans un erlenmeyer de grand et mettez-le de côté.
13. Introduire un nouveau morceau de gaze dans le filtre et répétez les étapes (2,7 – 2.12) jusqu'à ce que toutes les tumeurs ont été perturbés et filtrées.
14. Versez les téliospores filtrées dans autoclavés 250 mL Centrifugeuse bouteilles et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
15. Répétez l’étape 2.14 jusqu'à ce que tous les téliospores filtrées sont granulées par centrifugation.
16. Suspendre les granules dans un peu d’eau et transfert pour tubes de centrifugeuse 50 mL.
17. Centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
18. Suspendre le culot dans environ 50 mL de dH₂O, centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Racler doucement la couche grise avec une spatule et déposez-le. Répétez jusqu'à ce qu’il n’est plus une couche grise sur le dessus.
19. Sécher les échantillons durant la nuit dans un dessiccateur à vide.
20. Stocker des téliospores séchées à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
21. Si vous le souhaitez, traiter les téliospores avec sulfate de cuivre⁸ avant d’induire à germer. Si non traitée, puis exécutez approfondie analyse microscopique des téliospores pour confirmer l’échantillon représente des téliospores pures et est dépourvue de bactéries ou d’autres contaminations.
    1. Peser environ 50 mg de téleutospores dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Ajouter environ 1,0 mL de 0,75 % CuSO₄ dans le tube de microtubes de 1,5 mL contenant les téliospores. Pipetter haut et bas pour suspendre les téliospores dans la solution de CuSO₄ suivie d’agiter l’échantillon pendant 3 h.
    3. Centrifuger l’échantillon à 2 500 g pendant 5 min et retirer le surnageant. Resuspendre le culot de téliospores avec de l’eau stérile, répétez la centrifugation et éliminer le surnageant.
    4. Répétez l’étape 2.21.3 deux fois plus.

3. téliospores viabilité et Test de Germination

1. Peser environ 10 mg d’u. maydis téleutospores dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour évaluer leur viabilité et le moment de la germination.
2. Dans une armoire de biosécurité, préparer les bouillon de dextrose de pomme de terre (APB, 24 g/L) additionné de sulfate de streptomycine (160 µg/mL).
3. Suspendre les téliospores 500 µL de PDB. Pipetez doucement pour mélanger et briser tous les agrégats de téleutospores.
4. Transférer la suspension téliospores à une autoclave 250 mL fiole Erlenmeyer contenant 10 mL de l’APB.
5. Incuber le ballon à 28 ° C, secouant à 90 t/mn pendant 12 à 16 h.
6. Dans une armoire de biosécurité, enlever un échantillon de 20 µL des téleutospores amenées à germer et à préparer une lame de microscope.
7. À l’aide d’un microscope, évaluer visuellement les stades de la germination qui sont présents et la présence de contamination bactérienne.
   1. Compter le nombre de téleutospores à étapes I à V à l’aide d’un hémocytomètre et déterminer le pourcentage qui ont germé.
   2. Serait-ce que l’étape I téliospores sont présents, continuer à incuber le ballon pour un total de 24 h avant d’évaluer la germination des téliospores. Continuer d’incubation pour un maximum de 48 h avant que l’échantillon non viables.
   3. Si la contamination bactérienne est présente, Supplément de l’APB avec du sulfate de kanamycine (50 µg/mL) ainsi que le sulfate de streptomycine (160 µg/mL) et répétez les étapes 3.1 à 3.7. Si la contamination bactérienne persiste, traiter des téliospores avec du sulfate de cuivre et répétez les étapes 3.1 à 3.7.

4. l’induction de la Germination pour la surveillance de la Respiration

1. Peser la quantité égale (e.g., 50 mg) de téleutospores pour chaque expérience de la respiration.
2. Dans une armoire de biosécurité, ajouter téliospores devant une Assemblée de respiration autoclavés.
3. Remplir la chambre avec l’APB (24 g/L) additionné de sulfate de streptomycine (160 µg/mL) et du sulfate de kanamycine (50 µg/mL).
4. Pipetter en haut et en bas pour créer une suspension téliospores.
5. Placer le couvercle de la chambre dans la chambre pour créer joint étanche à l’air.

5. l’obtention de mesures de vitesses (OCR) de consommation d’oxygène

1. Placez la chambre dans le panier de la chambre à l’intérieur d’un bain d’eau (chauffé à 28 ° C).
2. Placez la sonde de₂ O à l’intérieur de l’ouverture de la chambre.
3. Surveiller les points de données qui apparaissent en temps réel sur le programme de « Taux de SensorTrace » et laisser la sonde stabiliser (~ 3 min après que la sonde est placée dans la chambre).
4. Cliquez sur « Mesure » pour mesurer les concentrations de₂ O en continu pendant 6 h avec mesures enregistrées à intervalles de 2 s.
5. Arrêter la mesure et répétez les étapes 4.1 – 5,4 pour chaque échantillon à analyser.
6. Exporter les données vers Microsoft Excel en cliquant sur « fichier | Export | Enregistrer sous .xls ».

6. analyse de données

1. Calculer les OCR
   1. Dans le fichier Excel exporté sous l’onglet « Within_Rates », enregistrer le « taux » pour chaque mesure de chambre (nmol/h).
   2. Pour chaque échantillon expérimental, soustraire le « taux » de la chambre vide depuis le « taux » de la chambre de l’échantillon expérimental afin d’obtenir une valeur corrigée de l’OCR et prendre la valeur absolue de ce nombre.
   3. Calculer le total OCR par mg de téliospores en divisant la valeur corrigée de OCR absolue par le cellulaire masse utilisé.
   4. Moyenne répliquer les valeurs « OCR par mg de téliospores » pour chaque souche.
2. Analyser les données à l’aide de la méthode statistique appropriée (p. ex.., de student t-test, analyse de variance) à l’aide de Microsoft Excel d’un autre logiciel de statistique.
3. Graphique des données brutes, de calculer le pourcentage d’oxygène restant pour chaque point de temps vous souhaitez graphique. Diviser la première lecture par elle-même et multiplier par 100 (100 % d’oxygène restant), puis divisez chaque lecture ultérieure par la première lecture et multiplier par 100 pour obtenir le pourcentage d’oxygène restant dans la chambre.

7. l’induction de la Germination des téliospores pour isoler les téleutospores à différents stades de la Germination

1. Préparer le PDB (24 g/L) additionné de sulfate de streptomycine (160 µg/mL) dans une armoire de sécurité biologique.
2. Placer environ 10 mg d’u. maydis téleutospores dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
3. Suspendre les téliospores 500 µL de PDB. Pipetez doucement pour bien mélanger jusqu'à ce qu’il n’y a aucun amas de téleutospores dans le milieu.
4. Transférer la suspension téliospores dans un erlenmeyer autoclavés 250 mL contenant APB complétée avec sulfate de streptomycine.
5. Incuber le flacon du jour au lendemain à 28 ° C, secouant à 90 tr/min.

8. préparation de la boîte de Pétri et micromanipulateur

1. Préparer un plat de Pétri (57 cm²) par pipetage rangées de gouttelettes microcapillaire PROCEDE de preparation et prélèvement d’échantillons.
   1. Pipetter 5 gouttes de₂O dH µL (x 4) dans la partie supérieure de la boîte de Pétri.
   2. Distribuer 2 µL (x3) de solution de stabilisation RNA sur la boîte de Pétri à utiliser pour la collecte d’échantillons.
   3. Pipetter 5 gouttes µL (x 30) de germination des téleutospores sur la boîte de Pétri.
2. Ajouter 15 mL d’huile minérale à la boîte de Pétri. S’assurer que toutes les gouttelettes sont recouvertes d’huile avant de procéder.
3. Préparer un microcapillaire avec un diamètre intérieur de 15 µm, bride de 1 mm, 55 mm de longueur et un angle de pointe de 20° en le plaçant dans le support microcapillaire et submergeant dans l’huile minérale où l’action capillaire permettra à l’huile minérale entrer le microcapillaire. Relâcher la pression dans le microcapillaire avant de le porter à la goutte d’eau. Aspirez pour préparer le microcapillaire avec de l’eau.

9. isolement de spécifiques au stade germination des téleutospores

1. En utilisant les contrôles de la micromanipulateur, placez le microcapillaire disposé sur un des gouttelettes de la germination. Pénétrer la goutte, d’abaisser la microcapillaire et apporter l’embouchure de la microcapillaire jusqu'à un téliospores en germination au stade de la germination d’intérêt.
2. Aspirer doucement pour capturer les téliospores en germination. Arrêter d’aspirer une fois la téliospore entré la microcapillaire. Répétez jusqu'à ce qu’il y a environ cinq téliospores dans le microcapillaire.
3. Relevez le microcapillaire avec le micromanipulateur et l’amener à la goutte de collection de solution de stabilisation RNA. Pénétrer la gouttelette et injecter les téliospores dans la goutte.
4. Répétez les étapes 8.1 à 8.3 jusqu'à environ 1 000 téliospores ont été capturés.

10. récupération des gouttelettes de Collection

1. Pipetter vers le haut de la goutte de la collection et la transférer sur le couvercle d’un tube de microtubes de 2,0 mL exempte de RNase/DNase. Retirez soigneusement l’huile minérale avec une pipette sans déranger la gouttelette de collection.
2. Utilisez les téliospores pour applications en aval telles que l’isolement du RNA.

Résultats

Utilisant la méthode de base microrespirometer Clark-type de mesurer les changements dans la respiration au cours de la germination et la dormance téliospores, nous a confirmé que les dormants téliospores présentent un faible niveau de la respiration (~ 1 075 µmol/h/mg), comparée à germer téliospores (~ 2 614 µmol/h/mg ; Figure 1 a). Il s’agit d’un changement de ~2.4-fold taux moyen de la respiration entre téliospores dormants et téliospores ...

Discussion

Pathogènes basidiomycète biotrophe causent milliards de dollars en pertes de récoltes par an. La grande majorité de ces agents pathogènes produire des téliospores qui font partie intégrante de la dispersion fongique et reproduction sexuée. Acquérir les connaissances du développement et la germination des téleutospores est essentielle à la compréhension de la propagation des maladies dévastatrices provoquées par ces champignons. Afin d’identifier les changements moléculaires aux points de contrôle clés...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004