חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

Summary

פטריות הזימה לגרום למחלות רבות החקלאי הרסנית. הם מופצים כמו teliospores רדום זה לנבוט בתגובה לאותות סביבתיים. אנו מכינים שתי שיטות כדי לחקור את השינויים המולקולריים במהלך הנביטה: מדידת נשימה עלייה כדי לזהות מטבולית הפעלה והערכה שינוי האירועים המולקולריים המתרחשים על-ידי בידוד teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים.

Abstract

פטריות הזימה הסוכנים etiological של מספר מחלות החקלאי הרסנית. הם מאופיינים על ידי הייצור של teliospores, אשר פיזור בעובי דופן סוכנים. Teliospores יכולים להישאר רדום במשך עשרות שנים. תרדמה מאופיין על-ידי קצב חילוף החומרים שיש נמוך, עצר ביוסינטזה macromolecular, הקטנו רמות של הנשימה. עם קבלת אותות סביבתי הנדרש, teliospores לנבוט לייצר הפלואידי תאים, אשר יכולים ליזום סיבובים החדש של זיהום. נביטה teliospore מאופיין על ידי חידוש ביוסינטזה macromolecular, נשימה מוגברת, שינויים מורפולוגיים דרמטי. על מנת למדוד בדיוק לשינויים נשימה תאית כבר בשלבים המוקדמים של נביטה, פיתחנו פרוטוקול פשוט העסקת respirometer קלארק-סוג. בשלבים מאוחרים יותר של נביטה נבדלים על ידי שינויים מורפולוגיים ספציפיים, אבל נביטה אסינכרוני. פיתחנו טכניקה microdissection המאפשרת לנו לאסוף teliospores בשלבי נביטה ברורים.

Introduction

הפטריות הזימה (Ustilaginales) מורכב מינים יותר מ- 1,600 להדביק עשבי כולל את גידולי גריסים חשוב של תירס, שעורה, חיטה, גרימת מיליארדי דולרים בפיצויי אובדן יבול מדי שנה¹. פטריות אלה מאופיינים על ידי הייצור של teliospores, אשר יש פיגמנט כהה קירות התא הסוכנים פיזור. Teliospores לפעול כדי לחסום. את החומר הגנטי במהלך הלחצים של פיזור בין צמחים פונדקאים, יכולות להימשך במצב רדום שנים². בתור שכזה, teliospores הם מרכיב חיוני של התפשטות המחלה.

על מנת ללמוד ביולוגיה teliospore, המעבדה שלנו מנצל הפטריה הזימה דגם זקן התירס פחמון (U. זקן התירס), אשר הוא סוכן סיבתי של המחלה 'נפוצות הזימה של תירס'. בוגר זקן התירס U. teliospores מאופיינים על ידי צמיחה מעצר, חילוף החומרים הסלולר מופחתת, רמות נמוכות של נשימה תאית³. בתנאים סביבתיים חיובית (למשל., הנוכחות של סוכרים מסוימים), זקן התירס U. teliospores לנבוט ולהשלים מיוזה, הפקת basidiospores אשר יכולים ליזום סיבובים החדש של זיהום. נביטה מאופיין על ידי נשימה מוגברת הפעילות לחזור מטבולית, את התקדמות בשלבים מורפולוגי הנצפה של נביטה⁴.

השלב ההתחלתי של נביטה כולל נשימה מוגברת ותפקוד מטבולית, עם זאת, ישנם אין סימנים מורפולוגיים של שינוי. המידות המקוריים של שינוי בדרכי הנשימה U. זקן התירס בוצעו מעל 50 שנים, מדידת צריכת החמצן manometrically עם מכשיר את הבקבוק ורבורג⁵. . פיתחנו שיטה חדשה, פשוטה של הלומדים מדויק שינויים בנשימה במהלך הנביטה teliospore על ידי מדידת צריכת החמצן במהלך הזמן מספר נביטה באמצעות microrespirometer קלארק-סוג של... בעבר השתמשנו בשיטה זו ללמוד שינוי בקצב הנשימה בין פראי-סוג מוטציות עם המיטוכונדריה פגומים⁶, והתאים הפלואידי זקן התירס בארצות הברית , יש להתאים את פרוטוקול כאן ללמוד שינויים בנשימה teliospore במהלך נביטה. זה מספק אמצעי זיהוי במדויק את התזמון של נשימה שינוי כך אנחנו יכולים לירות teliospores בזמן המתאים לאחר אתחול של נביטה לחקור בתחילת האירועים המולקולריים. ההתקדמות של נביטה ניתן בעקבות ברמה המיקרוסקופית, ברגע promycelia מגיח teliospore, אבל הטבע אסינכרוני עכבות בידודו של teliospores מספיק בשלב הנתון לחקירה. פיתחנו שיטה microdissection דומים לאלה המשמש עבור הפריה במבחנה לאיסוף פיזית teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים של נביטה.

Protocol

1. זיהום קלח תירס

1. לגדול זיה מייז (cv. הזהב בנטם) עד קלחי נוצרים החלו משי (כ 60 ימים).
2. תרבות הפלואידי תואם U. זקן התירס זנים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כאמור תיאר⁷.
3. להדביק באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כמו שתואר לעיל⁷קלחי תירס.

2. teliospore קציר

1. ציוד autoclave (ביכנר funnels, מבחנות ביכנר, בלנדרים, 250 מ ל צנטריפוגה בקבוקים, שפכטלים שטוח ומים) באמצעות תקן יבש מחזור עם סטריליזציה לפחות 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס (תקן מחזור נוזל מים).
2. הסרת נגוע קלחי מצמחים (כ 28-35 ימים שלאחר זיהום) באמצעות תער ולהגדיר את קלחי על מגש מכוסה ספסל מגן.
3. הסרת הגידולים קלחי עם סכין גילוח ולאסוף בתוך.
4. ממלאים כוס בלנדר מעבדה 250 מ עם גידולים עד כ 1/3 מלא ולהוסיף dH בלוק₂O עד כ 3/4 כוס בלנדר מלא. לשבש את הגידול על ידי הפועמים בבלנדר-נמוך, ובודקים.
5. לחבר את משאבת ואקום מלכודת מים ולאחר מכן בקבוקון ביכנר 1 ליטר.
6. משפך ביכנר גדול להכניס הבקבוק וקו החלק התחתון של משפך ביכנר עם ארבע שכבות של גזה.
7. הפעל את משאבת ואקום.
8. יוצקים על חלק גידולים homogenized דרך גזה מגרדים עם מרית.
9. שופכים קצת dH₂O לתוך בכותנה בכדי לנקות את teliospores דרך.
10. חזור עד ה-dH₂O עובר בכותנה. ברור.
11. לסחוט בכותנה המכיל חומר הומוגני הגידול לתוך המסנן כדי להבטיח teliospore מקסימלית התאוששות.
12. כאשר הבקבוק ביכנר 1 ליטר עולה קרוב מלא, לרוקן אותו לתוך בקבוקון Erlenmeyer גדול והנח אותו בצד.
13. להכניס פיסת גזה חדש המסנן, חזור על השלבים (2.7-2.12) עד כל הגידולים יש כבר משובשות, מסוננים.
14. שופכים את teliospores מסוננים לתוך בקבוקים צנטריפוגה בלוק 250 מ ל, צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ולאחר decant את תגובת שיקוע.
15. חזור על שלב 2.14 עד כל teliospores מסוננים הם מגורען על ידי צנטריפוגה.
16. להשעות את כדורי בכמות קטנה של מים, העברת צינורות צנטריפוגה 50 מ.
17. Centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 דקות, decant את תגובת שיקוע.
18. להשעות את צניפה כ- 50 מ של dH₂O centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 דקות, decant את תגובת שיקוע. בעדינות לגרד את השכבה העליונה אפור עם מרית, השלך אותו. חזור עד לא קיימת עוד שכבה אפורה למעלה.
19. יבש הדגימות לינה desiccator ואקום.
20. חנות teliospores יבשים ב 4 ° C עד השימוש.
21. אם רצונך בכך, לפנק את teliospores עם אבקת נחושת⁸ לפני גרימת כדי לנבוט. אם אינו מטופל, לאחר מכן לבצע ניתוח מעמיק מיקרוסקופיים של teliospores כדי לאשר המדגם מייצג teliospores טהור, והוא חף בקטריאלי או מציג אחרים.
    1. שוקלים לצאת כ 50 מ ג של teliospores בשפופרת 1.5 mL microcentrifuge.
    2. להוסיף כ- 1.0 מ"ל של 0.75% CuSO₄ הצינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל את teliospores. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות את teliospores בפתרון₄ CuSO ואחריו לזעזע את הדגימה במשך 3 שעות.
    3. Centrifuge המדגם-2,500 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר teliospore במים סטריליים, חוזר צנטריפוגה, ולהסיר את תגובת שיקוע.
    4. חזור על שלב 2.21.3 עוד פעמיים.

3. teliospore הכדאיות ובדיקה נביטה

1. שוקלים כ 10 מ ג של teliospores U. זקן התירס בצינור microcentrifuge 1.5 mL כדי להעריך את הכדאיות שלהם ואת העיתוי של נביטה.
2. באבטחה הקבינט, להכין תפוחי אדמה דקסטרוז מרק (PDB, 24 g/L) בתוספת סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/mL).
3. להשעות את teliospores ב µL 500 של PDB. פיפטה בעדינות כדי לערבב לשבור את כל הגושים של teliospores.
4. להעביר את המתלים teliospore 250מל בלוק הבקבוק Erlenmeyer המכיל 10 מ ל ה-pdb.
5. דגירה. הבקבוק ב 28 ° C רועדת-90 סל ד עבור h 12-16.
6. באבטחה הקבינט, הסר 20 דוגמאות µL teliospores המושרה כדי לנבוט ולהכין שקופית מיקרוסקופ.
7. באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ, להעריך בשלבי נביטה הקיימים ואת נוכחותם של זיהום חיידקי.
   1. לספור את מספר teliospores-שלבים אני דרך V באמצעות hemocytometer ולקבוע את אחוז יש מונבטים.
   2. אם רק שלב I teliospores קיימים, להמשיך דגירה. הבקבוק בסך 24 שעות לפני הערכת הנביטה teliospore. המשך הדגירה לתקופה מקסימלית של 48 שעות לפני שתתעב המדגם כלכלית.
   3. אם קיים זיהום חיידקי, תוספת ה-PDB עם kanamycin גופרתי (µg 50/mL) כמו גם סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/mL) ולאחר מכן חזור על שלבים 3.1 ל 3.7. אם זיהום בקטריאלי נמשכת, להתייחס teliospores עם נחושת גופרתית וחזור על שלבים 3.1 ל 3.7.

4. אינדוקציה של נביטה ניטור נשימה

1. שוקלים שווה (למשל., 50 מ"ג) של teliospores לניסוי בכל נשימה.
2. באבטחה הקבינט, להוסיף teliospores תא נשימה בלוק.
3. למלא החדר עם PDB (24 g/L) בתוספת סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/mL) ו kanamycin סולפט (50 µg/mL).
4. פיפטה למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה teliospore.
5. הנח את מכסה תא בחדר כדי ליצור חותם אוויר חזק.

5. הוצאת את מדידת קצב (OCR) של צריכת חמצן

1. מניחים את התא בארון חדר בתוך אמבט מים (טרופה עד 28 מעלות צלזיוס).
2. מניחים את המכשיר₂ O בתוך הפתח של החדר.
3. לנטר את נקודות הנתונים המופיעים בזמן אמת על התוכנית "SensorTrace קצב", והנח את החללית לייצב (~ 3 דקות אחרי החללית ממוקם בבית הבליעה).
4. לחץ על "מדד" כדי למדוד רמות₂ O ברציפות במשך 6 שעות עם מדידות הקליט במרווחי s 2.
5. לעצור את המדידה, וחזור על הצעדים 4.1 – 5.4 עבור כל דגימה להיות מנותח.
6. ייצוא הנתונים ל- Microsoft Excel על-ידי לחיצה על "קובץ | ייצוא | שמירה של. xls.

6. ניתוח נתונים

1. לחשב OCR
   1. בקובץ המיוצא Excel תחת הלשונית "Within_Rates", להקליט את "קצב" עבור כל אחת מהמידות קאמרית (nmol/h).
   2. עבור כל מדגם ניסיוני, להפחית את "קצב" החדר ריק "במחיר" של התא מדגם ניסיוני כדי לקבל ערך OCR המתוקן, ולקחת את הערך המוחלט של מספר זה.
   3. לחשב OCR הכולל לכל מ"ג של teliospores על-ידי חלוקת הערך המתוקן OCR המוחלט על ידי הטלפון הסלולרי בשימוש המוני.
   4. ממוצע לשכפל "OCR לכל מ"ג של teliospores"ערכים עבור כל זן.
2. לנתח את הנתונים באמצעות השיטה הסטטיסטית המתאימה (למשל., הסטודנט t-test, השונות) באמצעות Microsoft Excel של תוכנות סטטיסטיות אחרות.
3. גרף נתונים גולמיים, לחשב את אחוז החמצן הנותר עבור כל הזמן-נקודה שאתה רוצה גרף. לחלק את הקריאה הראשונה על ידי עצמו להכפיל ב- 100 (חמצן 100% הנותרים), מתחלק כל הקריאה הבאים הקריאה הראשונה, ואז להכפיל ב- 100 כדי לקבל את אחוז החמצן שנותרו בבית הבליעה.

7. אינדוקציה של נביטה Teliospore כדי לבודד Teliospores בשלבים שונים של נביטה

1. להכין PDB (24 g/L) בתוספת סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/מ"ל) באבטחה ארון.
2. מניחים כ 10 מ ג של teliospores U. זקן התירס לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
3. להשעות את teliospores ב µL 500 של PDB. פיפטה בעדינות לערבב עד אין גושים של teliospores בטווח הבינוני.
4. להעביר את המתלים teliospore את הבקבוק Erlenmeyer בלוק 250 מ ל, המכיל PDB בתוספת סטרפטומיצין סולפט.
5. דגירה. הבקבוק בן לילה ב 28 ° C רועדת במהירות של 90 סל ד.

8. הכנת צלחת פטרי, Micromanipulator

1. להכין צלחת פטרי (57 ס מ²) על-ידי שורות pipetting של טיפות microcapillary הכנה ולאחר איסוף הדגימה.
   1. פיפטה 5 µL (x 4) dH₂O טיפות לרוחב החלק העליון של הפטרי.
   2. פיפטה 2 µL (x3) של RNA פתרון מייצב על הפטרי כדי לשמש לאיסוף הדגימה.
   3. פיפטה 5 µL (x 30) טיפות הנבטת teliospores על הפטרי.
2. להוסיף 15 מ של שמן מינרלי הפטרי. ודא כי כל טיפות מכוסים על ידי שמן לפני שתמשיך.
3. הכן של microcapillary עם קוטר פנימי 15 מיקרומטר, 1 מ מ מקורבות, 55 מ"מ אורך, זווית עצה 20° על ידי הצבת זה בעל microcapillary, השוקע אותו בשמן מינרלי איפה נימיות יאפשר את שמן מינרלי להזין את microcapillary. לשחרר את הלחץ microcapillary לפני הבאתו לתקן ה-droplet מים. וביופסיה להכין את microcapillary עם מים.

9. בידוד של שלב ספציפי הנבטת Teliospores

1. באמצעות הפקדים של micromanipulator, להעביר את microcapillary מוכנים לאחד טיפות נביטה. לחדור ה-droplet, הנמך את microcapillary ולהביא הפה של microcapillary עד teliospore germinating בשלב של נביטה של עניין.
2. ריקון נוזלים באיטיות כדי ללכוד את teliospore germinating. תפסיק כ רפה בעברית, ברגע teliospore הזין את microcapillary. חזור עד ישנם כ חמש teliospores microcapillary.
3. הרימו את microcapillary עם micromanipulator ולהביא אותו ה-droplet אוסף של RNA מייצב פתרון. ה-droplet ולחבר להזריק את teliospores לתוך ה-droplet.
4. חזור על שלבים 8.1 ל 8.3 עד teliospores כ-1,000 נתפסו.

10. שחזור של אוסף רביב

1. פיפטה את ה-droplet אוסף, להעביר אותו המכסה של צינור microcentrifuge RNase/DNase ללא 2.0 mL. הסר בזהירות את שמן מינרלי עם פיפטה מבלי להפריע אוסף ה-droplet.
2. השתמש את teliospores עבור יישומים במורד הזרם כגון בידוד ה-RNA.

תוצאות

באמצעות השיטה מבוססת microrespirometer קלארק-סוג של מדידת שינויים בנשימה במהלך teliospore תרדמה, נביטה, אישרנו זאת teliospores רדום להפגין רמה נמוכה של הנשימה (~ 1,075 µmol/h/mg) לעומת הנבטת teliospores (~ 2,614 µmol/h/מ ג; איור 1 א'). זה מייצג שינוי ~2.4-fold קצב ממוצע של נשימה בין teliospores רדום teliospores ?...

Discussion

פתוגנים צמח biotrophic basidiomycete לגרום מיליארדי דולרים של הפסדים חיתוך מדי שנה. הרוב המכריע של פתוגנים אלה מייצרים teliospores המהווים חלק בלתי נפרד פיזור פטרייתי, רבייה מינית. צובר ידע של פיתוח, נביטה של teliospores היא קריטית להבנת את התפשטות המחלות ההרסניות הנגרמת על ידי אלה פטריות. על מנת לזהות את השינוי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004