Indagando Teliospore germinazione utilizzando analisi Microrespiration e Microdissection

Riepilogo

Smut funghi causano molte malattie devastanti agricoli. Sono dispersi come teliospores dormienti che germinano in risposta a stimoli ambientali. Descriviamo due metodi per studiare i cambiamenti molecolari durante la germinazione: aumento di respirazione per rilevare l'attivazione metabolica di misurazione e valutazione cambiando eventi molecolari isolando teliospores alle fasi morfologiche distinte.

Abstract

Smut funghi sono gli agenti eziologici di parecchie malattie devastanti agricoli. Sono caratterizzati dalla produzione di teliospores, che sono agenti di dispersione dalle pareti spesse. Teliospores possono rimanere latenti per decenni. La dormienza è caratterizzata da tassi metabolici bassi, in pausa biosintesi macromolecolari e notevolmente ha ridotto i livelli di respirazione. Alla ricezione di segnali ambientali richiesti, teliospores germinare per produrre cellule aploidi, che possono avviare nuovi cicli di infezione. Germinazione di teliospore è caratterizzata dalla ripresa delle biosintesi macromolecolari, respiratorio aumentato e drammatici cambiamenti morfologici. Al fine di misurare con precisione i cambiamenti nella respirazione cellulare durante le prime fasi di germinazione, abbiamo sviluppato un semplice protocollo che impiegano un respirometro Clark-tipo. Le successive fasi di germinazione si distinguono per specifici cambiamenti morfologici, ma la germinazione è asincrona. Abbiamo sviluppato una tecnica di microdissezione che permetta di raccogliere teliospores in fasi distinte di germinazione.

Introduzione

I funghi di fuliggine (Ustilaginales) consistono di oltre 1.600 specie che infettano erbe tra cui l'importante cereali di mais, orzo e grano, causando miliardi di dollari in perdite di raccolto ogni anno¹. Questi funghi sono caratterizzati dalla produzione di teliospores, che hanno la pelle scura delle pareti cellulari e sono gli agenti di dispersione. Teliospores funzione per proteggere il materiale genetico durante le sollecitazioni di dispersione tra piante ospiti e può persistere in uno stato dormiente per anni². Come tale, teliospores sono una componente essenziale della diffusione della malattia.

Al fine di studiare biologia teliospore, il nostro laboratorio utilizza il fungo di oscenità modello Ustilago maydis (U. maydis), che è l'agente causale della malattia 'comune oscenità di mais'. Maturo U. maydis teliospores sono caratterizzati da arresto della crescita, il metabolismo cellulare ridotto e bassi livelli di respirazione cellulare³. In condizioni ambientali favorevoli (ad es., la presenza di specifici zuccheri), U. maydis teliospores germinano e completare le basidiospore di meiosi, producendo che possono avviare nuovi cicli di infezione. Germinazione è caratterizzata da respiratorio aumentato, il ritorno ad metabolico attività e la progressione attraverso stadi morfologici osservabile di germinazione⁴.

La fase iniziale di germinazione include respiratorio aumentato e funzione metabolica, tuttavia, non esistono indicazioni morfologiche del cambiamento. Le misure originali del cambiamento respiratorio in U. maydis sono state effettuate da oltre 50 anni fa, misurare il consumo di ossigeno manometrico con un apparato di boccetta Warburg⁵. Abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice di studio precisi cambiamenti nella respirazione durante la germinazione teliospore misurando il consumo di ossigeno sopra un corso di tempo di germinazione utilizzando un microrespirometer Clark-tipo. Abbiamo precedentemente utilizzato questo metodo per studiare i cambiamenti nella frequenza respiratoria tra selvaggio-tipo cellule aploidi U. maydis e mutanti con i mitocondri difettosi⁶ed hanno adattato il protocollo qui per studiare i cambiamenti nella respirazione teliospore durante germinazione. Questo consente di identificare con precisione i tempi del cambiamento di respirazione in modo che noi possiamo target teliospores al momento opportuno dopo l'inizio della germinazione di indagare gli eventi molecolari iniziali. La progressione di germinazione può essere seguita microscopicamente una volta emerge il promycelia dalla teliospore, ma la natura asincrona ha inibito l'isolamento di abbastanza teliospores in una fase determinata per le indagini. Abbiamo sviluppato una tecnica di microdissezione simile a quelli utilizzati per la fecondazione in vitro per raccogliere fisicamente teliospores presso morfologiche distinte fasi di germinazione.

Protocollo

1. corn Cob infezione

1. Zea mays (c.v. Golden Bantam) di crescere fino a quando le pannocchie sono formate e hanno iniziato a seta (circa 60 giorni).
2. Cultura compatibile aploide U. maydis ceppi utilizzando protocolli standard come precedentemente descritto⁷.
3. Infettare le pannocchie di mais utilizzando protocolli standard come descritto in precedenza⁷.

2. teliospore raccolta

1. Impianti di autoclave (Büchner imbuti, boccette di Büchner, frullatori, bottiglie da 250 mL centrifuga, spatole piatte e acqua) utilizzando uno standard secco ciclo con almeno 30 min sterilizzazione a 121 ° C (ciclo standard di liquido per l'acqua).
2. Rimuovere infetti pannocchie da piante (circa 28 – 35 giorni post infezione) utilizzando un rasoio e pannocchie su un vassoio coperto di protettore di panca.
3. Rimuovere i tumori da pannocchie con una lama di rasoio e raccogliere in un becher.
4. Riempire una tazza da 250ml laboratorio frullatore con tumori fino a circa 1/3 pieno e aggiungere autoclavato dH₂O fino a quando la Coppa del frullatore è circa 3/4 pieno. Interferire con i tumori di pulsare il frullatore a bassa, fino a quando non omogeneizzato.
5. Collegare la pompa del vuoto in una trappola d'acqua e poi in una boccetta di Büchner 1L.
6. Inserire il grande filtro Büchner nel pallone e il fondo dell'imbuto Büchner con quattro strati di garza.
7. Accendere la pompa del vuoto.
8. Versare una parte dei tumori omogeneizzati attraverso la garza e raschiare con una spatola.
9. Versare alcuni dH₂O la garza per lavare il teliospores attraverso.
10. Ripetere fino a quando il dH₂O venendo attraverso la Garza è chiaro.
11. Strizzare la garza contenente il materiale omogeneizzato tumore nel filtro per garantire massima teliospore recupero.
12. Quando la beuta Büchner 1L è sempre vicino a pieno, svuotarlo in una beuta e grande e metterlo da parte.
13. Mettere un nuovo pezzo di garza nel filtro e ripetere i passaggi (2.7-2.12) fino a quando tutti i tumori sono stati interrotti e filtrati.
14. Versare il filtrato teliospores in bottiglie di centrifuga in autoclave da 250 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min e decantare il supernatante.
15. Ripetere il passaggio 2.14 fino a quando tutti i teliospores filtrati sono pellettati mediante centrifugazione.
16. Sospendere il pellet in una piccola quantità di acqua e trasferimento a provette centrifuga da 50 mL.
17. Centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 min e decantare il supernatante.
18. Sospendere il pellet in circa 50 mL di dH₂O, centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 min e decantare il supernatante. Raschiare delicatamente lo strato superiore grigio con una spatola e smaltirla. Ripetere fino a quando non c'è più uno strato grigio sulla parte superiore.
19. Secca dei campioni durante la notte in un essiccatore sotto vuoto.
20. Conservare secchi teliospores a 4 ° C fino all'utilizzo.
21. Se lo si desidera, è possibile trattare il teliospores con solfato di rame⁸ prima di indurre a germinare. Se non trattata, quindi eseguire approfondita analisi microscopica di teliospores per confermare il campione rappresenta teliospores puro ed è privo di contaminazioni batteriche o altri.
    1. Pesare circa 50 mg di teliospores in una microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Aggiungere 1,0 mL circa di 0,75% CuSO₄ nella provetta di microcentrifuga da 1,5 mL contenente il teliospores. Pipettare su e giù per sospendere il teliospores della soluzione di CuSO₄ seguita da agitare il campione per 3 h.
    3. Centrifugare il campione a 2.500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di teliospore con acqua sterile, ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante.
    4. Ripetere il passaggio 2.21.3 altre due volte.

3. teliospore vitalità e Test di germinazione

1. Pesare circa 10 mg di U. maydis teliospores in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per valutare la solidità finanziaria e i tempi di germinazione.
2. In una cappa di biosicurezza, preparare il brodo patata destrosio (PDB, 24 g/L) completato con solfato di streptomicina (160 µ g/mL).
3. Sospendere il teliospores in 500 µ l di PDB. Pipettare delicatamente per mescolare e rompere tutti i ciuffi di teliospores.
4. Trasferire la sospensione di teliospore a un autoclavato 250 mL flacone erlenmeyer contenente 10 mL del PDB.
5. Incubare la beuta a 28 ° C in agitazione a 90 rpm per 12 – 16 h.
6. In una cappa di biosicurezza, rimuovere un campione di 20 µ l di teliospores indotto a germinare e preparare un vetrino da microscopio.
7. Utilizzando un microscopio, valutare visivamente fasi di germinazione che sono presenti e la presenza di contaminazione batterica.
   1. Contare il numero di teliospores presso stadi da I attraverso V utilizzando un emocitometro e determinare la percentuale che hanno germinato.
   2. Se solo fase I teliospores sono presenti, continuare a incubare la beuta per un totale di 24 h prima di valutare la germinazione teliospore. Continuare l'incubazione per un massimo di 48 h prima ritenendo il campione non vitali.
   3. Se la contaminazione batterica è presente, completare il PDB con solfato di kanamicina (50 µ g/mL) e solfato di streptomicina (160 µ g/mL) e quindi ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7. Se persiste la contaminazione batterica, trattare teliospores con solfato di rame e ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7.

4. induzione di germinazione per il monitoraggio della respirazione

1. Pesano uguale quantità (ad es., 50 mg) di teliospores per ogni esperimento di respirazione.
2. In una cappa di biosicurezza, aggiungere teliospores in un'aula di respirazione in autoclave.
3. Pimento della camera con PDB (24 g/L) completati con streptomicina solfato (160 µ g/mL) e kanamicina solfato (50 µ g/mL).
4. Pipettare su e giù per creare una sospensione di teliospore.
5. Porre il coperchio della camera nella camera per creare aria tenuta stagna.

5. ottenere misure di tasso (OCR) del consumo di ossigeno

1. Posizionare la camera nel rack alloggiamento all'interno di un bagno di acqua (preriscaldato a 28 ° C).
2. Posizionare la sonda₂ O all'interno dell'apertura della camera.
3. Monitorare i punti dati che appaiono in tempo reale sul programma "Tasso di SensorTrace" e lasciare che la sonda stabilizzare (~ 3 min dopo che la sonda va posizionata nella camera).
4. Fare clic su "Misura" per misurare i livelli di₂ O continuamente per 6 h con misurazioni registrate a intervalli di 2 s.
5. Interrompere la misurazione e ripetere i passaggi 4.1 – 5,4 per ciascun campione da analizzare.
6. Esportare i dati in Microsoft Excel facendo clic su "File | Esportare | Salvare come. xls".

6. analisi dei dati

1. Calcolare OCR
   1. Nel file di Excel esportato sotto la scheda "Within_Rates", è necessario registrare il "tasso" per ogni misura di camera (nmol/h).
   2. Per ogni campione sperimentale, sottrarre il "tasso" della camera del vuoto dal "Prezzo" della camera del campione sperimentale per ottenere un corretto valore di OCR e prendere il valore assoluto di questo numero.
   3. Calcolare il totale OCR per mg di teliospores dividendo il valore corretto di OCR assoluto per il cellulare di massa utilizzato.
   4. Media di replicare i valori "OCR per mg di teliospores" per ogni ceppo.
2. Analizzare i dati utilizzando il metodo statistico appropriato (ad es., di student t-test, analisi della varianza) utilizzando Microsoft Excel altri software statistici.
3. Per rappresentare graficamente i dati grezzi, calcolare la percentuale di ossigeno rimanente per ogni punto di tempo che si desidera grafico. Dividere la prima lettura di per sé e moltiplicare per 100 (100% ossigeno restante), poi dividere ogni successiva lettura dalla prima lettura e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale di ossigeno residuo nella camera.

7. induzione di Teliospore germinazione per isolare Teliospores alle distinte fasi di germinazione

1. Preparare file PDB (24 g/L) completati con solfato di streptomicina (160 µ g/mL) in una cappa di biosicurezza.
2. Posto a circa 10 mg di U. maydis teliospores in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
3. Sospendere il teliospores in 500 µ l di PDB. Delicatamente la pipetta a mescolare fino a quando non ci sono nessun ciuffi di teliospores nel mezzo.
4. Trasferire la sospensione di teliospore un matraccio di Erlenmeyer autoclavato 250 mL contenente PDB completati con solfato di streptomicina.
5. Incubare la beuta durante la notte a 28 ° C in agitazione a 90 giri/min.

8. preparazione della capsula di Petri e micromanipolatore

1. Preparare un piatto di Petri (57 cm²) di pipettaggio righe di goccioline per microcapillary preparazione e raccolta del campione.
   1. Pipettare 5 µ l (x 4) dH₂O gocce nella parte superiore della capsula di Petri.
   2. Pipettare 2 µ l (x3) di soluzione di stabilizzazione di RNA su di Petri da utilizzare per la raccolta del campione.
   3. Pipettare 5 µ l (X30) gocce di germinazione teliospores sul piatto Petri.
2. Aggiungere 15 mL di olio minerale per la capsula di Petri. Garantire che tutte le goccioline sono coperti di olio prima di procedere.
3. Preparare un microcapillary con un diametro interno di 15 µm, 1 mm flangia, lunghezza 55 mm e un angolo di 20° Suggerimento inserendola nel supporto microcapillary e immergendo nell'olio minerale dove azione capillare permetterà l'olio minerale entrare il microcapillary. Rilasciare la pressione nel microcapillary prima di portarla alla gocciolina di acqua. Aspirato per preparare il microcapillary con acqua.

9. isolamento di Teliospores fase-specifici di germinazione

1. Utilizzando i controlli del micromanipolatore, spostare il preparato microcapillary ad uno delle goccioline di germinazione. Penetrare la gocciolina, abbassare il microcapillary e portare alla bocca di microcapillary fino a una germinazione teliospore nella fase di germinazione di interesse.
2. Aspirare lentamente per catturare la germinazione teliospore. Smettere di aspirare una volta il teliospore entrato il microcapillary. Ripetere fino a quando ci sono circa cinque teliospores nella microcapillary.
3. Alza il microcapillary con il micromanipolatore e portarlo per la goccia di raccolta della soluzione di stabilizzazione di RNA. Penetrare la goccia e iniettare il teliospores la goccia.
4. Ripetere i passaggi da 8.1 a 8.3 teliospores circa 1.000 sono stati catturati.

10. il recupero della collezione goccia

1. Pipettare fino la goccia di collezione e trasferirlo al coperchio di un tubo del microcentrifuge di 2,0 mL privo di RNAsi e dnasi. Rimuovere con cura l'olio minerale con una pipetta senza disturbare la goccia di raccolta.
2. Utilizzare il teliospores per applicazioni a valle come isolamento del RNA.

Risultati

Usando il metodo di base di microrespirometer di Clark-tipo misurare i cambiamenti nella respirazione durante teliospore dormienza e germinazione, abbiamo confermato che dormiente teliospores presentano un basso livello di respirazione (~ 1.075 µmol/h/mg) rispetto alla germinazione teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Questo rappresenta un cambiamento di ~2.4-fold in media tasso di respirazione tra teliospores dormienti e teliospores che sono stati s...

Discussione

Fitopatogeni basidiomicete biotrophic causano ogni anno miliardi di dollari in perdite di raccolto. La stragrande maggioranza di questi patogeni produce teliospores che sono parte integrante della dispersione fungine e riproduzione sessuale. Acquisire conoscenze dello sviluppo e germinazione di teliospores è fondamentale per comprendere la diffusione delle malattie devastanti causati da questi funghi. Al fine di identificare alterazioni molecolari nei punti chiave di controllo abbiamo messo a punto un metodo per identif...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004