Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

Zusammenfassung

Brandpilze verursachen viele verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie sind als schlafenden Brandsporen zerstreut, die als Reaktion auf ökologische Hinweise zu keimen. Wir skizzieren zwei Methoden zur Untersuchung von molekularer Veränderungen während der Keimung: Atmung Erhöhung um Stoffwechselaktivierung erkennen Messung und Bewertung von molekularen Ereignisse durch die Isolierung Brandsporen in verschiedenen morphologischen Stadien ändern.

Zusammenfassung

Brandpilze sind die ätiologischen Agenten mehrere verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie zeichnen sich durch die Produktion von Brandsporen, die dickwandigen Zerstreuung Agenten sind. Brandsporen können jahrzehntelang inaktiv bleiben. Die Keimruhe zeichnet sich durch niedrige Stoffwechselrate, Makromolekulare Biosynthese angehalten und Ebenen der Atmung stark reduziert. Nach Erhalt der erforderlichen Umweltsignale, Keimen Brandsporen um haploide Zellen zu produzieren, die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen kann. Teliospore Keimung zeichnet sich durch die Wiederaufnahme der makromolekularen Biosynthese, erhöhte Atmung und dramatische morphologische Veränderungen. Um Veränderungen der Zellatmung in den frühen Stadien der Keimung genau zu messen, haben wir ein einfaches Protokoll mit einem Clark-Typ Respirometer entwickelt. Die späteren Stadien der Keimung zeichnen sich durch spezifische morphologische Veränderungen, aber Keimung ist asynchron. Wir entwickelten eine Mikrodissektion-Technik, die es ermöglicht uns Brandsporen auf unterschiedliche Keimung Stufen zu sammeln.

Einleitung

Die Brandpilze (Ustilaginales) bestehen aus über 1.600 Arten, die Gräser, einschließlich der wichtigen Getreide Mais, Gerste und Weizen, verursacht Milliarden von Dollar in Ernteverluste zu infizieren jährlich¹. Diese Pilze sind gekennzeichnet durch die Produktion von Brandsporen, die haben Zellwände dunkel pigmentiert und sind die Agenten der Zerstreuung. Brandsporen um genetische Material bei den Belastungen der Verbreitung zwischen Wirtspflanzen Schild funktionieren und können in einem schlafenden Zustand für Jahre²bestehen. Als solche sind Brandsporen ein wesentlicher Bestandteil der Ausbreitung der Krankheit.

Um Teliospore Biologie zu studieren, nutzt unser Labor Modell Smut Pilz Ustilago Maydis (U. Maydis), die der kausalen Agent der Krankheit "gemeinsame Smut von Mais" ist. Reifen U. Maydis Brandsporen zeichnen sich durch Wachstum Verhaftung, reduzierte Zellstoffwechsel und geringe Zellatmung³. Bei günstigen Umweltbedingungen (zB., das Vorhandensein von bestimmten Zuckern), U. Maydis Brandsporen Keimen und komplette Meiose, Herstellung von forstwirtschafter die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen können. Keimung zeichnet sich durch erhöhte Atmung, die Rückkehr zur metabolischen Aktivität und das Fortschreiten durch erkennbare morphologische Stadien der Keimung⁴.

Die erste Phase der Keimung umfasst erhöhte Atmung und Stoffwechsel-Funktion, es gibt jedoch keine morphologischen Hinweise auf Veränderungen. Das original der Atemwege Änderung U. Maydis vor über 50 Jahren Messungen wurden Sauerstoffverbrauch manometrically mit einem Warburg Kolben Apparat⁵messen. Wir haben eine neue, einfache Methode des Studiums präziser Änderungen in der Atmung während der Keimung der Teliospore durch die Messung von Sauerstoff-Verbrauch über einen zeitlichen Verlauf der Keimung mit einem Clark-Typ-Microrespirometer entwickelt. Wir zuvor verwendet diese Methode, Veränderungen der Atemfrequenz zwischen Wildtyp studieren U. Maydis haploiden Zellen und Mutanten mit defekte Mitochondrien⁶, und haben das Protokoll hier angepasst, um Veränderungen in der Teliospore Atmung während zu studieren Keimung. Dadurch können das Timing der Atmung Änderung genau zu identifizieren, so dass wir zum gegebenen Zeitpunkt nach der Einleitung der Keimung zu frühen molekularen Ereignisse untersuchen Brandsporen ausrichten können. Das Fortschreiten der Keimung kann mikroskopisch verfolgt werden, sobald der Promycelia ergibt sich aus der Teliospore, aber die asynchrone Natur, die Isolation der genug Brandsporen zu einem gegebenen Zeitpunkt für die Untersuchung gehemmt. Wir entwickelten eine Mikrodissektion Technik ähnlich denen für die in-vitro- Befruchtung, um körperlich Brandsporen an verschiedene morphologische Stadien der Keimung zu sammeln.

Protokoll

(1) Corn Cob Infektion

1. Zea Mays (CV Golden Bantam) wachsen bis Kolben gebildet sind und damit, Seide (ca. 60 Tage begonnen haben).
2. Kultur kompatibel haploiden U. Maydis Stämme mit Standardprotokollen wie zuvor beschrieben⁷.
3. Maiskolben mit Standardprotokollen wie zuvor beschriebenen⁷zu infizieren.

2. Teliospore Ernte

1. Autoklaven-Ausrüstung (Büchner Trichter, Büchner Flasks, Mixer, 250 mL Zentrifuge Flaschen, flachen Spatel und Wasser) mit einem Standard-trocken-Zyklus mit mindestens 30 min Sterilisation bei 121 ° C (flüssige Standardzyklus für Wasser).
2. Entfernen Sie infizierten Maiskolben aus Pflanzen (ca. 28-35 Tage Post Infektion) mit einer Rasierklinge zu und setzen Sie die Maiskolben auf einem Tablett in Bank-Schutz abgedeckt.
3. Die Tumoren von Maiskolben mit einer Rasierklinge zu entfernen und in ein Becherglas sammeln.
4. Eine 250 mL-Labor-Mixbecher mit Tumoren bis zu ca. 1/3 voll füllen und autoklaviert dH₂O hinzufügen, bis der Mixbecher etwa 3/4 ist voll. Stören Sie die Tumore durch den Mixer bei niedrigen, Pulsieren, bis homogenisiert.
5. Verbinden Sie die Vakuumpumpe einen Wasserabscheider und dann eine Flasche 1 L Büchner.
6. Legen Sie großen Büchner Trichter in die Flasche und Boden Sie den des Büchner-Trichter mit vier Schichten von Gaze.
7. Schalten Sie die Vakuumpumpe.
8. Gießen Sie einen Teil der homogenisierten Tumoren durch die Gaze und kratzen mit einem Spachtel.
9. Gießen Sie einige dH₂O in die Gaze um die Brandsporen durch spülen.
10. Wiederholen Sie, bis die dH-₂O kommen durch die Gaze ist klar.
11. Wringen Sie die Gaze mit der homogenisierten tumormaterial in den Filter, um maximale Teliospore Erholung zu gewährleisten.
12. Wenn die Flasche 1 L Büchner ist nah an immer voll, leeren Sie ihn in eine große Erlenmeyerkolben und legen Sie sie beiseite.
13. Legen Sie ein neues Stück Gaze in den Filter und wiederholen Sie die Schritte (2,7 – 2,12), bis alle Tumoren gestört und gefiltert haben.
14. Gießen Sie die gefilterten Brandsporen in autoklaviert 250 mL Zentrifuge Flaschen und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min und Dekantieren Sie des Überstandes.
15. Wiederholen Sie Schritt 2.14, bis alle gefilterten Brandsporen durch Zentrifugation pelleted sind.
16. Unterbrechen Sie die Pellets in einer kleinen Menge von Wasser und Übertragung auf 50 mL Zentrifuge Röhren.
17. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 x g für 5 min und Dekantieren Sie des Überstandes.
18. Anhalten Sie das Pellet in ca. 50 mL dH₂O, Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.000 x g für 5 min und Dekantieren Sie des Überstandes. Mit einem Spatel und entsorgen Sie es sanft die grauen Deckschicht abkratzen. Wiederholen Sie, bis eine graue Schicht gibt es nicht mehr an der Spitze.
19. Trockenen Übernachtung die Proben in ein Vakuum Exsikkator.
20. Getrocknete Brandsporen bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
21. Auf Wunsch behandeln der Brandsporen mit Kupfersulfat⁸ vor der Induktion zu keimen. Wenn nicht behandelt wird, führen Sie gründliche mikroskopische Analyse der Brandsporen bestätigen die Probe steht für pure Brandsporen und ist frei von Bakterien oder anderen Verunreinigungen.
    1. Etwa 50 mg Brandsporen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch abwiegen.
    2. Die 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit der Brandsporen fügen Sie etwa 1,0 mL 0,75 % CuSO_{4 hinzu} . Pipette rauf und runter um den Brandsporen in der CuSO₄ Lösung gefolgt von agitieren die Probe für 3 h zu unterbrechen.
    3. Die Probe bei 2.500 x g für 5 min zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Aufschwemmen Sie Teliospore Pellet mit sterilem Wasser, wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den überstand zu.
    4. Wiederholen Sie Schritt 2.21.3 zwei weitere Male.

3. Teliospore Lebensfähigkeit und Keimung Test

1. Wiegen Sie ca. 10 mg U. Maydis Brandsporen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen und das Timing der Keimung.
2. Bereiten Sie in einen Schrank Biosafety Kartoffel Traubenzucker Brühe (PDB, 24 g/L) ergänzt mit Streptomycin Sulfat (160 µg/mL).
3. Aussetzen der Brandsporen in 500 µL PDB. Leicht zu mischen und brechen alle Klumpen von Brandsporen pipette.
4. Übertragen Sie die Teliospore Federung auf eine autoklaviert 250 mL Erlenmeyerkolben mit 10 mL der PDB.
5. Inkubieren Sie die Flasche bei 28 ° C schütteln bei 90 u/min für 12 – 16 Uhr.
6. Entfernen Sie in einen Schrank Biosafety eine 20 µL Probe der Brandsporen Keimen und bereiten einen Objektträger induziert.
7. Beurteilen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, visuell Stadien der Keimung, die vorhanden sind und das Vorhandensein der bakteriellen Kontamination.
   1. Die Anzahl der Brandsporen an inszeniert ich durch V mit einem Hemocytometer und bestimmen die Prozent, die gekeimt haben.
   2. Wenn auch nur Phase I Brandsporen vorhanden sind, weiterhin die Flasche für eine Gesamtmenge von 24 h vor der Beurteilung Teliospore Keimung inkubieren. Weiter Inkubation für maximal 48 h vor erachtend die Probe nicht lebensfähig.
   3. Wenn bakterielle Kontamination vorliegt, ergänzen Sie die PDB-Datei mit Kanamycin Sulfat (50 µg/mL) sowie Streptomycin Sulfat (160 µg/mL) und dann wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.7. Bakterielle Kontamination besteht weiterhin, behandeln Sie Brandsporen mit Kupfersulfat zu, und wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.7.

(4) die Induktion der Keimung zur Überwachung der Atmung

1. Gleich viel wiegen (zB., 50 mg) der Brandsporen für jedes Experiment Atmung.
2. In ein Kabinett Biosafety Brandsporen Hinzufügen einer autoklaviert Atmung Kammer.
3. Füllung der Kammer mit PDB (24 g/L) ergänzt mit Streptomycin Sulfat (160 µg/mL) und Kanamycin-Sulfat (50 µg/mL).
4. Pipette rauf und runter, um eine Teliospore Aussetzung zu erstellen.
5. Deckel in der Kammer luftdichten Abdichtung Kammer.

5. Erhalt Sauerstoff Verbrauch (OCR) Messungen

1. Legen Sie die Kammer in der Kammer-Rack in einem Wasserbad (28 ° c vorgewärmt).
2. Legen Sie die O-₂ -Sonde in der Öffnung der Kammer.
3. Überwachen Sie der Datenpunkte erscheinen in Echtzeit auf dem "SensorTrace-Rate"-Programm, und lassen Sie die Sonde zu stabilisieren (~ 3 min nachdem die Sonde in die Kammer gebracht wird).
4. Klicken Sie auf "Messen" O₂ Ebenen kontinuierlich für 6 h mit Messungen aufgezeichnet in 2 s Abständen zu messen.
5. Stoppen Sie die Messung zu, und wiederholen Sie die Schritte 4.1 – 5,4 für jede Probe analysiert werden.
6. Die Daten nach Microsoft Excel exportieren, indem Sie auf "Datei | Exportieren | Als .xls speichern Sie".

(6) Datenanalyse

1. Berechnen Sie OCR
   1. Zeichnen Sie in der exportierten Excel-Datei auf der Registerkarte "Within_Rates" auf "Rate" für jede Kammer-Messung (Nmol/h).
   2. Subtrahieren Sie für jede experimentelle Probe "Rate" der leere Kammer von der "Rate" von der experimentellen Probenraum um eine korrigierte OCR-Wert zu erhalten, und nehmen Sie der Absolute Wert dieser Zahl zu.
   3. Berechnen Sie die gesamten OCR pro mg Brandsporen durch Division den korrigierten absolute OCR-Wert durch die zelluläre Masse verwendet.
   4. Durchschnitt zu replizieren "OCR pro mg Brandsporen" Werte für jede Belastung.
2. Analysieren Sie die Daten mit entsprechenden statistischen Methode (zB., Student t-Test, Analyse der Varianz) mithilfe von Microsoft Excel der anderen Statistiksoftware.
3. Raw Daten grafisch darstellen, Berechnen der Sauerstoffgehalt bleibt für jeden Zeitpunkt, die Sie grafisch darstellen möchten. Ersten Lesung durch selbst teilen multiplizieren mit 100 (100 % Sauerstoff verbleibende), dann teilen Sie jede nachfolgende Messung durch die erste Lesung und multiplizieren mit 100 Prozent des Sauerstoffs, die noch in der Kammer zu erhalten.

(7) Induktion von Teliospore Keimen Brandsporen in unterschiedlichen Stadien der Keimung zu isolieren

1. Bereiten Sie PDB (24 g/L) ergänzt mit Streptomycin Sulfat (160 µg/mL) in eine biologische Kabinett vor.
2. Legen Sie etwa 10 mg U. Maydis Brandsporen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
3. Aussetzen der Brandsporen in 500 µL PDB. Sanft, Pipette, mischen, bis es keine Klumpen von Brandsporen im Medium gibt.
4. Übertragen Sie die Teliospore Federung auf eine autoklaviert 250 mL-Erlenmeyerkolben mit PDB ergänzt mit Streptomycin Sulfat.
5. Inkubieren Sie die Flasche über Nacht bei 28 ° C bei 90 u/min schütteln.

8. Vorbereitung der Petrischale und Mikromanipulator

1. Vorbereiten einer Petrischale (57 cm²) durch pipettieren Reihen von Tröpfchen Microcapillary Vorbereitung und Probenentnahme.
   1. Pipette 5 µL (x 4) dH₂O Tröpfchen am oberen Rand der Petrischale.
   2. Pipette 2 µL (x3) RNA-Stabilisierung-Lösung auf der Petrischale für die Probenahme verwendet werden.
   3. Pipette 5 µL (x 30) Wassertropfen Keimen Brandsporen auf der Petrischale.
2. Die Petrischale 15 mL Mineral Öl hinzufügen. Sicherstellen Sie, dass alle Tröpfchen durch Öl, bevor Sie fortfahren.
3. Bereiten Sie einen Microcapillary mit einer 15 µm Innendurchmesser, 1 mm Flansch, 55 mm Länge und einem Winkel von 20° Tipp indem man es in der Microcapillary Inhaber und Eintauchen in das Mineralöl wo Kapillarwirkung das Mineralöl der Microcapillary eingeben können. Lassen Sie den Druck in der Microcapillary, bevor es auf den Wassertropfen. Zur Vorbereitung der Microcapillary mit Wasser abzusaugen.

9. Isolation der Bühne-spezifische Keimen Brandsporen

1. Verwenden die Steuerelemente der Mikromanipulator, verschieben Sie die vorbereiteten Microcapillary zu einem der Keimung Tröpfchen. Dringen Sie des tröpfchens ein, senken Sie die Microcapillary und bringen Sie die Mündung des Microcapillary bis zu einer keimenden Teliospore in der Phase der Keimung von Interesse zu.
2. Aspirieren Sie langsam um die keimenden Teliospore zu erfassen. Stoppen Sie, absaugen, sobald die Teliospore die Microcapillary getreten ist. Wiederholen Sie, bis in den Microcapillary gibt es etwa fünf Brandsporen.
3. Heben Sie die Microcapillary mit dem Mikromanipulator und Sammlung Tröpfchen von RNA Stabilisierung Lösung bringen. Dringen die Tröpfchen und injizieren der Brandsporen in das Droplet.
4. Wiederholen Sie die Schritte 8.1, 8.3 bis ca. 1.000 Brandsporen erfasst wurden.

10. Wiederherstellung der Sammlung Droplet

1. Pipette auf die Sammlung Tröpfchen und überträgt es auf den Deckel einer RNase/DNase-freie 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen Sie vorsichtig das Mineralöl mit einer Pipette ohne zu stören die Sammlung Tröpfchen.
2. Verwenden Sie die Brandsporen für downstream-Anwendungen wie z. B. RNA-Isolierung.

Ergebnisse

Mit der Clark-Typ Microrespirometer-basierte Methode zur Messung der Veränderungen der Atmung während der Vegetationsruhe Teliospore und Keimung, bestätigt wir, dass schlafende Brandsporen ein niedriges Niveau der Atmung (~ 1.075 µmol/h/mg weisen) im Vergleich zu keimen Brandsporen (~ 2.614 µmol/h/mg; Abbildung 1A). Dies stellt eine ~2.4-fold Änderung im durchschnittlichen Rate von Atmung zwischen schlafenden Brandsporen und Brandsporen, die induziert w...

Diskussion

Basidiomycete biotrophe Pflanzenpathogene verursachen jährlich Milliarden von Dollar in Ernteausfälle. Die überwiegende Mehrheit dieser Erreger produzieren Brandsporen, die integraler Bestandteil der Pilz Zerstreuung und geschlechtliche Fortpflanzung. Bei der Entwicklung und Keimung der Brandsporen zu gewinnen ist entscheidend für das Verständnis der Ausbreitung der verheerenden Krankheiten verursacht durch diese Pilze. Um molekulare Veränderungen an wichtigen Kontrollpunkten zu ermitteln haben wir eine Methode, um...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptomycin Sulfate	BioShop	STP101
Kanamycin Sulfate	BioShop	KAN201
Potato Dextrose Broth	BD Difco	254920
1 L Waring Laboratory blender	Waring	7011S
Cheesecloth	VWR	470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode Meter Amplifier	Unisense	N/A
MR-Ch Small	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate Software	Unisense	N/A
MicroRespiration Rack	Unisense	MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer	Unisense	MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope	Zeiss
Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-202ND
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004