Detección de virus de bioaerosoles utilizando resina de intercambio aniónico

Resumen

Un anión intercambio método basado en la resina, adaptado para muestreo de bioaerosol basado en el choque de los virus se demuestra el líquido. Cuando se combina con detección molecular aguas abajo, el método permite la detección fácil y sensible de virus de bioaerosoles.

Resumen

Este protocolo muestra un método de muestreo de bioaerosol modificado para requisitos particulares en busca de virus. En este sistema, resina de intercambio aniónico es junto con dispositivos de muestreo de aire líquido basado en el choque para la concentración eficaz de virus cargado negativamente de bioaerosoles. Así, la resina sirve como un paso adicional de la concentración del flujo de trabajo de muestreo de bioaerosol. Extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales se realiza directamente en la resina de intercambio aniónico, con la muestra que resulta adecuada para los análisis moleculares. Además, este protocolo describe una cámara de un bioaerosol capaz de generar bioaerosoles cargados de virus en una variedad de condiciones ambientales y que permite el monitoreo continuo de variables ambientales como temperatura, humedad, velocidad del viento y concentración masiva de aerosoles. La principal ventaja de utilizar este protocolo es el aumento de la sensibilidad de la detección viral, evaluada mediante comparación directa con un impactor de líquido convencional sin modificar. Otras ventajas incluyen el potencial de concentrar diversos virus cargado negativamente, el bajo costo de la resina de intercambio aniónico (~$0.14 por ejemplo) y la facilidad de uso. Desventajas incluyen la incapacidad de este protocolo para evaluar la infectividad de resina adsorbe las partículas virales, y potencialmente la necesidad de la optimización de la solución de muestreo líquido utilizado en el impactor.

Introducción

El propósito de este método es proporcionar una plataforma de muestreo de bioaerosol altamente sensible para facilitar la detección molecular de virus cargado negativamente de bioaerosoles. Microorganismos, incluyendo partículas virales, pueden sobrevivir en bioaerosoles durante largos períodos de tiempo¹. Bioaerosoles pueden viajar distancias relativamente largas y mantener la viabilidad e infectividad, evidenciada por un brote de legionelosis que se originó de Torres ubicados a una distancia de 6 km de los individuos afectados de refrigeración industrial y dio lugar a 18 fatalidades². Transmisión indirecta del virus a los seres humanos mediados por bioaerosoles puede ocurrir en múltiples escenarios y se ha demostrado para brotes de norovirus en escuelas y restaurantes^3,4. Del mismo modo, bioaerosol transmisión del virus puede ocurrir en ambientes agrícolas como en las granjas de cerdos y aves de corral, con esta ruta de transmisión se considera como un factor importante en el movimiento del virus entre producción instalaciones^{5, 6 , 7 , 8 , 9}.

Efectivo muestreo de bioaerosoles cargados de virus permite la mejora en el diagnóstico rápido y la preparación para la prevención del brote, como se muestra en las manifestaciones en que H5 de bioaerosoles en el animal vivo se detectaron un virus de la influenza los mercados en China y la Estados Unidos^10,11. Tecnologías de muestreo de bioaerosol actuales implican a una serie de principios de captura de partículas diferentes y se pueden categorizar ampliamente en impingers, impactadores, ciclones y filtros¹². Está más allá del alcance de este protocolo para cubrir exhaustivamente todas las ventajas y desventajas de estas plataformas para muestreo de virus de bioaerosoles; sin embargo, se puede afirmar que la mayoría de estos dispositivos de muestreo no ha sido optimizada para la colección de virus y bacteriófagos¹³. Además, infectividad de las partículas virales se afectados a menudo negativamente, con impingers líquidos considerados mantener infectividad viral más eficazmente que muestras como impactadores o filtros sólidos¹⁴. Sin embargo, una desventaja de choque líquida es el efecto de dilución del blanco, que ocurre porque el virus se recogen en volúmenes relativamente grandes (normalmente ≥ 20 mL) de líquido en el recipiente de colección. Otra desventaja importante implica la eficacia subóptima de impingers líquidos a concentrar partículas < 0,5 μm de tamaño¹⁵. Sin embargo, la eficiencia de captura de estos dispositivos puede mejorarse mediante inmovilización en matrices sólidas, como inmovilización puede mejorar la preservación de los ácidos nucleicos virales y de infectividad viral^16,17.

Previamente hemos demostrado que la resina del intercambio de aniones es una herramienta eficaz para la captación y concentración de virus en matrices líquidas, incluyendo F-RNA bacteriófagos, virus de la hepatitis A, adenovirus humano y rotavirus^{18,19 ,20}. Según lo definido por el fabricante, la resina de intercambio aniónico utilizada en este trabajo es una resina de intercambio de anión base fuerte poliestireno macroreticular en que amina cuaternario funcionalizados grupos medie atracción y captura de aniones en un medio líquido²¹ . En consecuencia, la resina de intercambio aniónico se espera capturar virus con cargas superficiales neto negativo, incluyendo muchos de los virus entéricos, virus de la influenza y otros virus relevantes para la salud pública y animal.

El protocolo actual consiste en la adición de resina de intercambio aniónico para un líquido impinger. En este sistema, la resina sirve como paso secundario de la concentración de partículas virales en el líquido impinger. Los ácidos nucleicos pueden ser eluidos directamente en volúmenes pequeños, proporcionando una muestra concentrada para análisis moleculares. Así, la principal ventaja de este método es la mejora en sensibilidad de detección viral, principalmente a través de la reducción en el volumen de la muestra. Además, debido a la inherente captura no específicos de virus cargado negativamente, el método es probable aplicable para la detección de un gran número de virus de interés. Aquí, el método se demuestra cepas vacunales de virus de la influenza tipo B, tipo A y el FRNA colifago MS2 (MS2). Estos virus son detectados posteriormente usando análisis de qRT-PCR estándar como se describió anteriormente²². El usuario final no debe esperar dificultades en la realización de este método, debido a modificaciones existentes en la actualidad equipos no constituyen importantes interrupciones en el flujo convencional de bioaerosol muestreo y análisis.

Protocolo

1. configuración de la cámara de Bioaerosol (ver figura 2)

1. Cargue previamente el líquido impingers con 20 mL de 0.01 M tamponada fosfato salino, pH 7,5 (PBS).
   1. Añadir 0,5 g de resina de intercambio aniónico y suspender en el PBS de uno de los impingers líquidos, con otro líquido impinger que sirve como control.
2. Impingers líquidos de posición en paralelo dentro de la cámara de bioaerosol utilizando soportes de abrazadera con entradas de aerosoles hacia el nebulizador.
   Nota: Véase la figura 2 para detalles adicionales.
3. Ubicar a un monitor de lectura directa aerosoles cerca de los impingers líquidos para medir la concentración en masa (mg/m³) del bioaerosol.
4. Ubicar el instrumental de lectura directa adicional (aire interior calidad monitor y Termo Anemómetro) cerca de los impingers líquidos para monitorear las variables ambientales, como temperatura, humedad relativa y viento velocidad, dentro de la cámara del bioaerosol.
5. Funcionamiento de ventiladores axiales en las esquinas de la cámara de bioaerosol para facilitar la mezcla del aerosol.
   Nota: Los ventiladores axiales corren a una velocidad fija y no ajustables.

2. modelo Bioaerosolization experimentos (ver figura 3)

1. Realizar entregas, 10 veces las diluciones de vacuna contra la influenza y bacteriófago MS2 deseado concentraciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   Nota: Para demostrar el método, 10^3.5 FFU/mL del tipo A y B influenza virus vacuna cepas y 10 se utilizan⁵ PFU/mL del bacteriófago MS2. Para determinar los títulos de los inóculos, bacteriófagos son propagados en Escherichia coli HS (pFamp) R y enumerados como se describió anteriormente²⁰. La vacuna comercial contiene cantidades conocidas de cuatro cepas de virus de la gripe atenuados vivos, dos tipo un virus de la influenza y dos virus de influenza tipo B, expresados en unidades de foco fluorescente o FFU.
2. Preparación de inóculos en el recipiente de vidrio de un nebulizador de chorro de 6 colisión mediante la creación de suspensiones de deseado concentraciones de partículas virales en 100 mL de PBS e instale dentro de la cámara de bioaerosol personalizado.
3. Iniciar la instrumentación para medir las variables dentro de la cámara de bioaerosol, tales como temperatura, % de humedad relativa, concentración de dióxido de carbono y viento (generado usando un ventilador axial). Usar a un monitor de lectura directa aerosol concentración en masa dentro de la cámara de bioaerosol de la pista y establecer coherencia en y entre los ensayos.
4. Sellar la cámara de bioaerosol y purgar por 10 min con aire filtrado por HEPA.
5. Entregan aire filtrado y seco en el nebulizador funciona a 6,9 kPa.
6. Generar una concentración objetivo de bioaerosoles viral (vía nebulizador) en cada cámara de bioaerosol ensayo. Para esta demostración, se generan bioaerosoles con una concentración de 5 mg/m³ .
7. Una vez alcanzada la concentración en masa del aerosol objetivo, detener la nebulización.
8. Operar una bomba de muestreo de aire para cada impinger líquido que ha sido calibrado para un caudal de 12,5 L/min conducta calibración con un estándar primario de flujo antes y después de cada evento de muestreo para garantizar la consistencia en el volumen de muestreo. Fuente de dilución de aire usando una línea de filtrado HEPA situada cerca de la ampolla y mantener presión constante en la cámara.
9. Activamente de la muestra la atmósfera de la cámara de bioaerosol durante un período de 40 minutos para lograr un volumen de muestreo de 500 L por muestra.
   Nota: Toma de muestras durante 40 min a 12,5 L/min con dos bombas en paralelo permite para muestreo de 1.000 L del bioaerosol. Así, al finalizar el experimento, se espera que la mayoría del aire presente en la cámara de bioaerosol ha sido muestreada y liberados en el medio ambiente mediante un sistema de filtrado HEPA. Esto se evidencia por la disminución en la concentración de partículas. Posterior al experimento, las superficies son descontaminadas con el 10% hogar blanqueador y el 70% de etanol. Indicadores se utilizan en esta demostración; sin embargo, si se conocen organismos patógenos se utilizan en este sistema, medidas de bioseguridad adicionales pueden implementarse según sea necesario.

3. extracción y detección de qRT-PCR

1. Aislar los ácidos nucleicos de resina de intercambio aniónico y, para fines comparativos, el líquido utilizado en impingers líquidos. En este ejemplo, se describe un procedimiento de aislamiento de RNA, pero un protocolo similar podría ser utilizado para el virus de la DNA.
   1. Aislamiento de ácidos nucleicos de la resina de intercambio aniónico.
      1. Transferir todo el líquido que contiene la resina del anión intercambio de impactor líquido a un tubo cónico estéril 50 mL.
      2. Permite la resina para instalarse y decantar lentamente la muestra líquida de la resina de intercambio aniónico. Utilice una pipeta de 1 mL para eliminar todo el líquido restante de la resina de intercambio aniónico.
      3. De un kit de aislamiento de RNA viral, agregar 560 μl de tampón de lisis viral que contiene RNA transportista directamente a la resina de intercambio aniónico e incubar 10 min a temperatura ambiente con mezcla de periódico.
      4. Utilizando una pipeta de 1 mL, transferir el viral lisado (el tampón de lisis viral) a una estéril 1,5 mL cónico del tubo y proceder con el ARN aislamiento utilizando un aislamiento de RNA viral kit (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante, excepto que el RNA se eluyó en un volumen total de 60 μL de tampón de elución.
   2. Aislamiento de ácidos nucleicos de impingers líquidos.
      1. Pipetee 140 μl de la muestra líquida en un tubo cónico de 1.5 mL estéril y realizar aislamiento de RNA utilizando el kit de aislamiento de RNA viral con arreglo a las instrucciones del fabricante, con la excepción de liberador de RNA en un volumen total de 60 μL de tampón de elución.
         Nota: 140 μl es el volumen máximo de la muestra que puede ser procesado con el kit de aislamiento de viral específico de la RNA que empleado aquí en una solo paso preparación.
2. Realizar qRT-PCR para la detección de MS2 y influenza A y B virus como se describió anteriormente^23,24. En esta demostración, se utilizan 5 μl de ácido nucleico eluatos por qRT-PCR.

Resultados

Figura 1 muestra el principio de captura basados en la carga de virus de bioaerosoles mediante inserción de resina en base líquida impingers. La figura 2 muestra la configuración de la cámara de un bioaerosol. Figura 3 se describen los pasos necesarios para configurar el experimento de aerosolización y medidas para control de calidad. La figura 4 muestra curvas de a...

Discusión

Este protocolo describe un método para la captura de viral sensible de bioaerosoles utilizando impingers líquidos modificados. El método se ha optimizado para la detección y cuantificación de la carga viral en bioaerosoles. La modificación específica demostrada aquí consiste en la adición de resina de intercambio aniónico líquido contenida en un impinger líquido común. Este método fue desarrollado por su sencillez en el procesamiento de las muestras aguas abajo, mientras que otras técnicas de procesamiento...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)	American Type Culture Collection	ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent	AstraZeneca	Contact manufacturer	Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195
Primers and probes	Integrated DNA Technologies	NA
0.2 µM sterile filter	NA	NA
1 L pyrex bottles or equivalent	NA	NA
1 mL pipet tips	NA	NA
1 mL pipettor	NA	NA
50 mL serological pipet	NA	NA
PCR tubes	NA	NA
Pipet-aid or equivalent	NA	NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit	Qiagen	204443
Amberlite IRA-900 chloride form	Sigma-Aldrich	216585-500G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Water (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher	13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher	14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher	05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX	ThermoFisher	11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set	SKC Inc.	225-9593
Vac-u-Go sample pumps	SKC Inc.	228-9695
Collison nebulizer (6-jet)	BGI Inc.	NA
HEPA capsule	PALL	12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554	TSI Inc.	NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A	TSI Inc.	NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor	TSI Inc.	NA
Bioaerosol chamber	NA	NA