JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Анион обмен метода на основе смолы, адаптированных к жидкости, продемонстрированную выборки на основе покушение Биоаэрозоль вирусов. При сочетании с течению молекулярной обнаружения, метод позволяет легким и чувствительных обнаружения вирусов из биоаэрозоли.

Аннотация

Этот протокол демонстрирует метод выборки настроить Биоаэрозоль на вирусы. В этой системе анион обмен смолы в сочетании с жидкого воздуха, покушение на основе выборки устройства для эффективной концентрации отрицательно заряженные вирусов от биоаэрозоли. Таким образом смолы служит дополнительной концентрации шага в рабочем Биоаэрозоль выборки. Нуклеиновые кислоты добыча вирусных частиц затем выполняется непосредственно из смолы обмен анион, с результирующей выборки, подходит для молекулярного анализа. Кроме того этот протокол описывает заказ Биоаэрозоль камеры, способные генерировать вирус Ладена биоаэрозоли под разнообразные условия окружающей среды и позволяющие непрерывный мониторинг экологических переменных, таких как температура, влажность, скорость ветра и массовой концентрации аэрозолей. Главным преимуществом использования этого протокола является повышенная чувствительность обнаружения вирусных, как оценивать через прямое сравнение в неизмененном обычного жидкого Импинджера. Другие преимущества включают возможность сосредоточиться отрицательно заряженные различных видов вирусов, низкая стоимость анион обмен смолы (~$0.14 на сэмпл) и простота использования. Недостатки включают неспособность оценить инфективности смолы адсорбированные вирусных частиц настоящего Протокола, и потенциально потребность в оптимизации жидких проб буфера используется внутри Импинджера.

Введение

Цель этого метода является обеспечение высокочувствительный Биоаэрозоль выборки платформы для облегчения молекулярной обнаружение отрицательно заряженные вирусов от биоаэрозоли. Микроорганизмов, в том числе вирусные частицы, могут выжить в биоаэрозоли для длительных периодов времени1. Биоаэрозоли могут путешествовать на относительно большие расстояния и поддерживать жизнеспособность и инфективности, о чем свидетельствует вспышка болезни легионеров, породивший от промышленных охладительных башен, расположенных на расстоянии 6 км от пострадавших лиц и в результате 18 погибших2. Косвенные передачи вирусов для людей при посредничестве биоаэрозоли может произойти в нескольких параметров и продемонстрировал норовирус вспышек в школах и ресторанов3,4. Аналогично Биоаэрозоль передачи вирусов может произойти в сельскохозяйственных параметры в фермах свиней и птицы, такие как с этот путь передачи, рассматривается как важный фактор в движении вирусов между производства зал5, 6 , 7 , 8 , 9.

Эффективное выборки вируса Ладена биоаэрозоли позволяет улучшить в быстрой диагностики и готовности к предотвращению вспышки, как показано в демонстрациях, в котором H5 от биоаэрозоли в живых животных были обнаружены вирусы гриппа рынков в Китае и Соединенные Штаты Америки10,11. Текущий Биоаэрозоль выборки технологии включают ряд различных частиц захвата принципов и может быть широко разделены на impingers, циклоны, ударных и фильтры12. Это выходит за рамки сферы охвата настоящего Протокола исчерпывающим образом охватывать все преимущества и недостатки этих платформ для выборки вирусов из биоаэрозоли; Однако можно отметить, что большинство этих устройств выборки не были оптимизированы для коллекции вирусы и бактериофаги13. Кроме того инфективности вирусных частиц часто негативно влияет, с жидким impingers, считается, что более эффективно, чем выборка устройств, таких как твердых ударных или фильтры14поддерживать вирусные инфективности. Однако недостатком жидкости покушение является целевой разрежающего эффект, который возникает потому, что вирусы собраны в относительно больших объемах (обычно каналов ≥20 мл) жидкости в сосуде сбора. Еще одним важным недостатком предполагает субоптимальные эффективность жидких impingers сконцентрировать частицы < 0,5 мкм в размер15. Однако эффективность захвата этих устройств может быть улучшена путем иммобилизации на твердой матрицы, как иммобилизация может повысить сохранность вирусных нуклеиновых кислот и вирусных инфективности16,17.

Ранее мы показали, что анион обмен смола является эффективным инструментом для захвата и концентрация вирусов из жидкого матриц, включая F-РНК бактериофагов, вирус гепатита А, человека аденовирус и ротавирусной18,19 ,20. Как это определено изготовителем, смола обмен анион, широко использовались в этой работе является смола обмен полистирола сильная база анион macroreticular в котором функционализированных четвертичные амины группы посредничества привлечения и захват анионов в жидкость средних21 . Следовательно обмен смолы анион ожидается захват вирусов с net отрицательные поверхности обвинения, включая многие кишечных вирусов, вирусов гриппа и других вирусов, касающихся здоровья населения и животных.

Текущий протокол включает в себя добавление анион обмен смолы для жидкого Импинджера. В этой системе смолы служит средней концентрации шаг для вирусных частиц, захваченных в Импинджера жидкости. Нуклеиновые кислоты может затем быть непосредственно этого eluted в небольших объемах, обеспечивая концентрированного образца для молекулярного анализа. Таким образом основным преимуществом этого метода является улучшение чувствительность обнаружения вирусных, главным образом за счет сокращения объема выборки. Кроме того, из-за присущего неспецифической захвата отрицательно заряженные вирусов, метод вряд ли применимо для обнаружения большого числа вирусов, представляющих интерес. Здесь метод продемонстрировал для вакцины против штаммов типа A и вирусы гриппа типа B и FRNA Колифаги мс2 (МС2). Впоследствии эти вирусы обнаруживаются с помощью стандартных qRT ПЦР-анализы как описано22. Конечного пользователя не следует ожидать сталкиваются с трудностями в выполнении этого метода, поскольку изменения в существующих в настоящее время оборудование не представляют собой серьезные нарушения обычного потока Биоаэрозоль отбора проб и анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Установка камеры Биоаэрозоль (см. Рисунок 2)

  1. Предварительно загрузите жидкого impingers с 20 мл 0,01 М фосфат буфер солевой, рН 7,5 (PBS).
    1. Добавить 0,5 г аниона обмен смолы и приостановить в PBS одного из жидкого impingers, с другой жидкости Импинджера, выступающей в качестве элемента управления.
  2. Позиция жидких impingers параллельно внутри Биоаэрозоль камеры с помощью зажима стенды с вводами аэрозоля, стоящих перед прибором.
    Примечание: Для дополнительных сведений см.
  3. Размещайте монитор прямого чтения аэрозолей вблизи жидкие impingers для измерения массовой концентрации (3мг/м) Биоаэрозоль.
  4. Разместить дополнительную прямого чтения приборов (качество воздуха в помещениях монитор и тепловой анемометра) вблизи жидкие impingers для мониторинга экологических переменных, таких как температура, относительная влажность и ветер скорость, в Биоаэрозоль камере.
  5. Выполните осевые вентиляторы в углах Биоаэрозоль камеры для облегчения смешивания аэрозоля.
    Примечание: Осевые вентиляторы работают на фиксированной скорости и не являются регулируемыми.

2. модель Bioaerosolization эксперименты (см. рис. 3)

  1. Выполните последовательный, десятикратного разведений MS2 бактериофага и гриппа вакцины до требуемой концентрации фосфатов амортизированное saline (PBS).
    Примечание: Чтобы продемонстрировать метод здесь, 103.5 ФФУ/мл тип A и B гриппа вакцины против штаммов вируса и 10 используются5 ОРП/мл бактериофага MS2. Чтобы определить титры для инокуляты, бактериофагов распространяются в Escherichia coli HS (pFamp) R и перечислены как описано выше20. Коммерческие вакцины содержит известные количества четырех штаммов вируса живой аттенуированной вакцины гриппа, два типа вирусов гриппа и два вирусы гриппа типа B, выражается в флуоресцентного фокус единиц или ФФУ.
  2. Подготовка инокуляты в стеклянный сосуд распылитель 6-Джет столкновения путем создания суспензии желаемой концентрации вирусных частиц в 100 мл PBS и установить в пределах пользовательского Биоаэрозоль камеры.
  3. Инициируйте инструментария для измерения переменных в Биоаэрозоль камере, таких как температура, относительная влажность в %, концентрация двуокиси углерода и ветер (созданные с помощью осевой вентилятор). Используйте монитор прямого чтения аэрозоля для отслеживания массовой концентрации в Биоаэрозоль камере и установить последовательность в пределах и между испытаниями.
  4. Печать Биоаэрозоль камеры и очистить за 10 мин с НЕРА фильтрации воздуха.
  5. Доставить отфильтрованных, сухой воздух в распылитель, работающих на 6,9 кПа.
  6. Генерировать целевой концентрацию вирусной биоаэрозоли (через небулайзер) в каждой судебной камере Биоаэрозоль. Для этой демонстрации генерируются биоаэрозоли с концентрацией 5 мг/м3 .
  7. После того, как будет достигнут целевой Массовая концентрация аэрозоля, остановите распыления.
  8. Работать насос для отбора проб воздуха для каждого жидкого Импинджера, который откалиброван для скорости потока 12,5 Л/мин поведения калибровки с помощью стандартного первичного потока до и после каждого события выборки для обеспечения последовательности в объем выборки. Подачи разрежающего воздуха с помощью НЕРА фильтрации строки, расположенные вблизи ингалятор и поддерживать постоянное давление в камере.
  9. Активно образец Биоаэрозоль камерную атмосферу в течение 40 мин для достижения выборки объем 500 Л на сэмпл.
    Примечание: Выборки 40 мин на 12,5 Л/мин с двумя насосами параллельно позволяет для выборки 1,000 л Биоаэрозоль. Таким образом по завершении эксперимента, ожидается, что большинство из присутствующих в зале Биоаэрозоль воздуха было проб и в окружающую среду через систему фильтрации HEPA. Это подтверждается снижением концентрации частиц. После эксперимента, поверхности являются обеззаражен с 10% бытовой отбеливатель и 70% этанола. Показатели используются в этой демонстрации; Однако если известно, что в этой системе используются патогенных организмов, дополнительные биобезопасности меры могут осуществляться при необходимости.

3. Нуклеиновые кислоты добыча и qRT ПЦР обнаружение

  1. Изолируйте нуклеиновые кислоты непосредственно из смолы обмен анион и для целей сравнения, от жидкости, используемые в жидких impingers. В этом примере описана процедура изоляции РНК, но аналогичный протокол могут быть использованы для ДНК вирусов.
    1. Нуклеиновые кислоты изоляции от смолы обмен анион.
      1. Передать все анион обмен смолы содержащие жидкости жидкие Импинджера стерильные 50 мл Конические трубки.
      2. Разрешить смолы урегулировать и медленно сцеживаться жидкого образца из смолы обмен анион. Используете наконечник пипетки 1 мл раствора для удаления всех оставшихся жидкости из смолы обмен анион.
      3. С комплектом изоляции вирусной РНК 560 мкл буфера lysis вирусных, содержащий перевозчику РНК непосредственно анион обмен смолы и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре с периодическим перемешиванием.
      4. С помощью кончика пипетки 1 мл, передачи вирусных lysate (вирусный литического буфера) для стерильных 1,5 мл конические пробки и приступить к РНК изоляции с помощью вирусной РНК изоляции комплект (см. Таблицу материалы) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением что является этого eluted РНК в суммарный объем 60 мкл буфера.
    2. Нуклеиновые кислоты изоляции от жидкого impingers.
      1. Пипетка 140 мкл жидкого образца в стерильных 1,5 мл конические и выполнять РНК изоляции с помощью вирусной РНК изоляции комплект в соответствии с инструкциями производителя, за исключением элюирующие РНК в суммарный объем 60 мкл буфера.
        Примечание: 140 мкл является объем максимальной образца, который может быть обработан в конкретных вирусной РНК изоляции комплект работающих здесь, в единый этапа подготовки.
  2. Выполните qRT ПЦР для выявления MS2 и гриппа A и B вирусы как описано23,24. В этой демонстрации 5 мкл элюаты нуклеиновых кислот используются для qRT-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 демонстрирует принцип, лежащий в основе заряда захват вирусов от биоаэрозоли через включение смолы в основе жидких impingers. Рисунок 2 показывает настройку камеры на заказ Биоаэрозоль. Рисунок 3 описывает шаги по н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает метод для чувствительных вирусный захвата от биоаэрозоли, с использованием модифицированных жидкий impingers. Оптимизированный метод для обнаружения и количественного определения вирусной нагрузки в биоаэрозоли. Конкретные изменения, продемонстрировали здесь в?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансирование из CDC/NIOSH высокие равнины межгорной центра сельскохозяйственных здоровья и безопасности (5U54OH008085) и Программа грантов оценки Колорадо Bioscience обнаружения (14BGF-16).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)American Type Culture CollectionATCC 15597-B1
FluMist QuadrivalentAstraZenecaContact manufacturerViral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195
Primers and probesIntegrated DNA TechnologiesNA
0.2 µM sterile filterNANA
1 L pyrex bottles or equivalentNANA
1 mL pipet tipsNANA
1 mL pipettorNANA
50 mL serological pipetNANA
PCR tubesNANA
Pipet-aid or equivalentNANA
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52904
QuantiTect Probe RT-PCR KitQiagen204443
Amberlite IRA-900 chloride formSigma-Aldrich216585-500G
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK
Water (molecular biology grade)Sigma-AldrichW4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge TubesThermoFisher05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROXThermoFisher11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass setSKC Inc.225-9593
Vac-u-Go sample pumpsSKC Inc.228-9695
Collison nebulizer (6-jet)BGI Inc.NA
HEPA capsulePALL12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554TSI Inc.NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-ATSI Inc.NA
SidePak AM510 personal aerosol monitorTSI Inc.NA
Bioaerosol chamberNANA

Ссылки

  1. Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
  2. Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
  3. Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
  4. Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
  5. Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444(2013).
  6. Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
  7. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
  8. Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401(2015).
  9. Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
  10. Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
  11. Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
  12. Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
  13. Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121(2017).
  14. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
  15. Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
  16. Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
  17. Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
  18. Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
  19. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
  20. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
  21. Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
  22. Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
  23. Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
  24. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
  25. Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
  26. Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
  27. Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
  28. Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
  29. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138qRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены