זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף

Summary

אניון להחליף שיטה מבוססת-שרף, הותאם לנוזל הוכח bioaerosol מבוסס-impingement דגימה של וירוסים. כאשר יחד עם זיהוי מולקולרי במורד הזרם, השיטה מאפשרת גילוי נתיישב ורגיש של וירוסים bioaerosols.

Abstract

פרוטוקול זה מדגים שיטת הדגימה bioaerosol מותאם אישית עבור וירוסים. במערכת זו, אניון exchange שרף הוא ביחד עם התקני הדגימה האוויר מבוסס-impingement נוזלי ריכוז אפקטיבי של אניון וירוסים bioaerosols. לפיכך, השרף מגישה כשלב נוסף ריכוז בזרימת העבודה bioaerosol הדגימה. חומצת גרעין החילוץ של חלקיקי נגיפי ואז מבוצעת ישירות מן השרף exchange אניון, עם הדגימה וכתוצאה מכך מתאים ניתוחים מולקולריים. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר תא bioaerosol לפי הזמנה מסוגל לייצר וירוס עמוסי bioaerosols תחת מגוון תנאים סביבתיים, המאפשר ניטור רציף של משתנים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, מהירות הרוח, ריכוז מסה תרסיס. היתרון העיקרי של שימוש בפרוטוקול זה הוא רגישות מוגברת של איתור נגיפי, כפי העריך באמצעות השוואה ישירה impinger נוזלי קונבנציונאלי שלא שונתה. יתרונות נוספים כוללים את היכולת להתרכז מגוונים-אניון וירוסים, עלות נמוכה של אניון exchange שרף (~$0.14 עבור דגימה), וקלות השימוש. החסרונות כוללים חוסר היכולת של פרוטוקול זה כדי להעריך את infectivity של שרף-הספוחה נגיפים, שעשוי להיות לצורך אופטימיזציה של המאגר דגימה נוזלית שישמש impinger.

Introduction

מטרת שיטה זו היא לספק פלטפורמה דגימה רגישה מאוד bioaerosol כדי להקל על זיהוי מולקולרי של אניון וירוסים bioaerosols. מיקרואורגניזמים, כולל חלקיקים נגיפיים, יכול לשרוד bioaerosols לתקופות ממושכות של זמן¹. Bioaerosols ניתן לנסוע על פני מרחקים ארוכים יחסית, לשמור על יכולת הקיום של infectivity, כפי שמעידים על התפרצות מחלת הליגיונרים כי מקורם התעשייה ממוקם במרחק של 6 ק מ אנשים מושפעים במגדלי הקירור ו כתוצאה 18 הרוגים². שידור ישיר של וירוסים לבני מתווכת על-ידי bioaerosols יכול להתרחש במסגרות מרובות, הוכח עבור norovirus התפרצויות^3,של בתי ספר, מסעדות-⁴. באופן דומה, bioaerosol שידור של וירוסים יכול להתרחש אצל חקלאי הגדרות כגון בחוות חזירים ועופות, עם המסלול לשידור להיחשב כגורם מרכזי בתנועה של וירוסים בין מתקני הייצור^{5, 6 , 7 , 8 , 9}.

הדגימה האפקטיבי של bioaerosols עמוסי וירוס מאפשר שיפור איבחונים ומוכנות למניעת התפרצות, כפי שמוצג בהפגנות ב H5 אילו שפעת וירוסים התגלו מ bioaerosols ב החי משווקת בסין ו ארצות הברית^10,11. טכנולוגיות הנוכחי של הדגימה bioaerosol לערב מספר עקרונות ללכוד חלקיקים שונים, ניתן לסווג בהרחבה לתוך impingers, הציקלונים, impactors, מסננים¹². . זה מעבר הטווח של פרוטוקול זה לכסות ממצה את כל היתרונות והחסרונות של פלטפורמות אלה עבור דגימה של וירוסים מן bioaerosols; עם זאת, ניתן לקבוע כי הרוב המכריע של התקנים אלה דגימה שלא להיות ממוטבות עבור האוסף של וירוסים ותוכנות bacteriophages¹³. יתר על כן, infectivity של נגיפים לעיתים קרובות מושפעים לרעה, עם impingers נוזלי נחשב כדי לשמור על infectivity ויראלי בצורה יעילה יותר מאשר דגימה התקנים כגון impactors או מסננים מוצק¹⁴. אולם חיסרון אחד של impingement נוזלי הוא האפקט דילול המטרה, אשר מתרחשת מפני וירוסים הם שנאספו בכמויות גדולות יחסית (בדרך כלל ≥ 20 מ"ל) של נוזל בתוך הכלי אוסף. חיסרון חשוב נוסף כרוך יעילות שיוצרת impingers נוזלי להתרכז חלקיקים < 0.5 מיקרומטר גודל¹⁵. עם זאת, ניתן לשפר יעילות לכידה של התקנים אלה מאת הנייח על מטריצות מוצק, כפי הנייח יכול לשפר את שימור של חומצות גרעין נגיפיות,^16,infectivity ויראלי¹⁷.

בעבר הראו כי אניון exchange שרף הוא כלי יעיל עבור לכידת וריכוז של וירוסים של מטריצות נוזלי, לרבות F-RNA bacteriophages, וירוס הפטיטיס A, אדנו אדם בנגיף^{18,19 ,20}. כפי שהוגדרו על ידי היצרן, השרף exchange אניון מנוצל בעבודה זו הוא שרף macroreticular פוליסטירן אניון בסיס חזק exchange האטרקציה התחלקות של קבוצות functionalized אמין רבעוני, לכידתו של אניונים בינוני נוזלי²¹ . כתוצאה מכך, צפוי השרף exchange אניון ללכוד וירוסים עם חיובים השטח נטו שלילי, לרבות וירוסים המעית רבים, שפעת וירוסים, וירוסים אחרים הנוגעים לבריאות הציבור ובעלי חיים.

בפרוטוקול הנוכחי כולל התוספת של אניון exchange לשרף impinger נוזלי. במערכת זו, משמש השרף צעד ריכוז משניות עבור חלקיקים נגיפיים שנלכדו בתוך הנוזל impinger. חומצות גרעין יכול אז להיות ישירות eluted בכמויות קטנות, מתן דגימת מרוכז עבור ניתוחים מולקולריים. לפיכך, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשיפור הרגישות לאיתור נגיפי, בעיקר באמצעות צמצום נפח דגימה. בנוסף, בשל התפיסה שאינם ספציפיים הטבועה של וירוסים אניון, השיטה זו סביר ישימה עבור זיהוי של מספר גדול של וירוסים עניין. כאן, השיטה הוא הפגין עבור חיסון זנים של סוג A, וירוסים שפעת מסוג B, את coliphage FRNA MS2 (MS2). וירוסים אלה מאותרים לאחר מכן באמצעות מבחני לרביעיית סטנדרטי-PCR כמו שתואר לעיל²². המשתמש מובילים לא צריך לצפות למפגש קשיים בביצוע שיטה זו, כי השינויים הקיימים כיום ציוד אינם מהווים מרכזי שיבושים לזרימה המקובלת של bioaerosol דיגום וניתוח.

Protocol

1. הגדרת החדר Bioaerosol (ראה איור 2)

1. לטעון מראש את impingers נוזלי 20 מ של 0.01 M פוספט buffered מלוחים, pH 7.5 (PBS).
   1. להוסיף 0.5 g של אניון exchange שרף, השעיה בתוך מגניב של אחד impingers נוזלי, עם עוד impinger נוזלי הגשה פקד.
2. מיקום impingers נוזלי במקביל בתוך החדר bioaerosol באמצעות מלחציים עומד עם תרסיס אינלטס מול של מפוחים.
   הערה: ראה איור 2 לפרטים נוספים.
3. בשיתוף אתר צג תרסיס ישיר-קריאה ליד impingers נוזלי כדי למדוד ריכוז מסה (מ ג/ז³) של bioaerosol.
4. אתר שיתוף ישיר-קריאה נוספים ומכשור (אוויר מקורה איכות צג ותרמית מד רוח) ליד impingers נוזלי לעקוב אחר משתני סביבה, כגון טמפרטורה, לחות יחסית רוח מהירות, בתוך תא bioaerosol.
5. הפעל מאווררים ציריים בפינות החדר bioaerosol כדי להקל על ערבוב של תרסיס.
   הערה: מאווררים ציריים לרוץ במהירות קבועה והם אינם מתכווננת.

2. מודל Bioaerosolization ניסויים (ראה איור 3)

1. לבצע יציאה טורית, 10-fold דילולים bacteriophage MS2 חיסון שפעת ריכוזי הרצוי בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
   הערה: כדי להדגים את השיטה פה, 10^3.5 ffu ב/mL של סוג A ו- B שפעת וירוס חיסון זנים ו-10⁵ PFU/mL של bacteriophage MS2 מנוצלים. כדי לקבוע titers עבור inocula, bacteriophages הופץ ב- HS Escherichia coli (pFamp) R, לספור כפי שתואר לעיל²⁰. החיסון המסחרי מכיל כמויות ידוע של ארבעה זנים של וירוס שפעת הקלוש בשידור חי, שניים הקלד שפעת ווירוסים שני וירוסים שפעת מסוג B, שבאה לידי ביטוי המוקד פלורסנט יחידות או ffu.
2. להכין inocula בתוך הכלי זכוכית של לתת לה משאף 6-סילון התנגשות על-ידי יצירת המתלים של ריכוזים הרצוי של נגיפים ב- 100 מ של PBS ולהתקין בתוך תא bioaerosol מותאם אישית.
3. ליזום מכשור כדי למדוד את משתני בתוך תא bioaerosol, כגון טמפרטורה, לחות יחסית %, ריכוז פחמן דו-חמצני, ורוח מהירות (נוצר באמצעות של מפוח). השתמש צג תרסיס ישיר-קריאה כדי לעקוב אחר ריכוז מסה בתוך תא bioaerosol ולהקים עקביות בתוך ובין ניסויים.
4. לאטום את התא bioaerosol ולטהר 10 דקות באוויר HEPA-מסוננים.
5. לספק אוויר מסונן, מיובשים מפוחים פועלים ב 6.9 kPa.
6. הפקת ריכוז היעד של bioaerosols ויראלי (באמצעות מפוחים) בכל אחד bioaerosol למשפט. לצורך ההדגמה, bioaerosols עם ריכוז של 5 מ"ג/m³ נוצרים.
7. לאחר שהגעת היעד ריכוז מסה בתרסיס, עוצרים nebulization.
8. פועלים משאבת אוויר דגימה עבור כל impinger נוזלי זה כוילה כדי קצב זרימה של 12.5 L לדקה כיול התנהגות באמצעות תקן הזרימה הראשי לפני ואחרי כל אירוע הדגימה כדי להבטיח עקביות דגימה נפח. דילול אספקת אוויר באמצעות שורת HEPA-מסוננים הממוקמים על יד מפוחים, לשמור על לחץ קבוע בבית הבליעה.
9. פעיל לדגום את האווירה תא bioaerosol לתקופה של 40 דקות כדי להשיג נפח דגימה של 500 ליטר לכל דגימה.
   הערה: דגימה למשך 40 דקות ב- 12.5 L/דקה עם שתי משאבות במקביל מאפשר דגימה של 1,000 ליטר של bioaerosol. לכן, בתום הניסוי, הוא צפוי כי רוב האוויר נוכח בבית הבליעה bioaerosol שנדגמו, שוחרר לתוך הסביבה דרך מערכת סינון HEPA. עדות לכך היא על ידי הירידה בריכוז החלקיקים. שלאחר הניסוי, משטחים הם ושוקמו עם 10% אתנול ביתי מלבין ו- 70%. נעשה שימוש במחוונים בהפגנה זו; עם זאת, אם ידוע אורגניזמים פתוגניים משמשים במערכת זו, אמצעי אבטחה נוספים ניתן ליישם בהתאם לצורך.

3. חומצות גרעין חילוץ וזיהוי לרביעיית-PCR

1. לבודד חומצות גרעין ישירות מאניון exchange שרף, למטרות השוואתי, מן הנוזל שישמש את impingers נוזלי. בדוגמה זו, מתואר הליך בידוד ה-RNA, אך פרוטוקול דומה יכול לשמש לייצור DNA וירוסים.
   1. חומצת גרעין בידוד מן השרף exchange אניון.
      1. העברת כל של אניון exchange המכילים שרף הנוזל של impinger נוזלי צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
      2. לאפשר שרף להתיישב, לאט decant את דגימת נוזל מן השרף exchange אניון. השתמש טיפ פיפטה 1 מ"ל כדי להסיר את כל הנוזל הנותר מן השרף exchange אניון.
      3. ערכה בידוד RNA נגיפי, להוסיף µL 560 פירוק ויראלי מאגר המכיל נושא RNA ישירות כדי שרף exchange אניון, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב תקופתיים.
      4. באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, להעביר את נגיפי lysate (המאגר פירוק ויראלי) סטרילי 1.5 מ ל חרוט צינור ולהמשיך עם RNA בידוד באמצעות בידוד RNA נגיפי של קיט (ראה טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן, למעט כי ה-RNA eluted, הנפח הכולל של µL 60 • תנאי המאגר.
   2. חומצת גרעין בידוד של impingers נוזלי.
      1. פיפטה µL 140 המדגם נוזלי לתוך צינור חרוטי mL 1.5 סטרילי ולבצע בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA נגיפי בהתאם להוראות היצרן, חוץ eluting רנ א ב הנפח הכולל של µL 60 • תנאי המאגר.
         הערה: 140 µL היא אמצעי האחסון מדגם מקסימלית ניתן לעבד עם ספציפי נגיפי RNA בידוד ערכת המועסקים כאן הכנה צעד אחר צעד.
2. לבצע לרביעיית-PCR לזיהוי של MS2, שפעת A ו- B וירוסים כמו שתואר לעיל^23,24. בהפגנה הזו, 5 µL של חומצות גרעין eluates משמשים לרביעיית-PCR.

תוצאות

איור 1 מדגים את העיקרון שמאחורי מבוסס תשלום לכידתו של וירוסים מ- bioaerosols באמצעות הכללת שרף בנוזל impingers. איור 2 מציג את ההתקנה של תא bioaerosol לפי הזמנה. איור 3 מתאר את השלבים הכרוכים בהקמת חשוד ניסוי של אמצעים כדי להבטיח בקרת איכות....

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור לכידת ויראלי רגיש bioaerosols משתמש ששונה impingers נוזלי. השיטה ממוטבת זיהוי, כימות המטען הנגיפי ב- bioaerosols. השינוי מסוימות המודגמות כאן כרוכה התוספת של אניון שרף exchange לנוזל הנכלל של impinger נוזלי נפוצות. שיטה זו פותחה עבור פשטותו בעיבוד מדגם במורד הזרם, ואילו דוגמת עיבוד טכני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)	American Type Culture Collection	ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent	AstraZeneca	Contact manufacturer	Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195
Primers and probes	Integrated DNA Technologies	NA
0.2 µM sterile filter	NA	NA
1 L pyrex bottles or equivalent	NA	NA
1 mL pipet tips	NA	NA
1 mL pipettor	NA	NA
50 mL serological pipet	NA	NA
PCR tubes	NA	NA
Pipet-aid or equivalent	NA	NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit	Qiagen	204443
Amberlite IRA-900 chloride form	Sigma-Aldrich	216585-500G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Water (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher	13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher	14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher	05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX	ThermoFisher	11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set	SKC Inc.	225-9593
Vac-u-Go sample pumps	SKC Inc.	228-9695
Collison nebulizer (6-jet)	BGI Inc.	NA
HEPA capsule	PALL	12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554	TSI Inc.	NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A	TSI Inc.	NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor	TSI Inc.	NA
Bioaerosol chamber	NA	NA