JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir anyon reçine tabanlı yöntemi bioaerosol sıkışma tabanlı örnekleme virüslerin gösterdi sıvı için uyarlanmış değişimi. Aşağı akım moleküler algılama ile birleştiğinde, yöntem bioaerosols virüslerden facile ve hassas algılanması için izin verir.

Özet

Bu iletişim kuralı virüsler için özelleştirilmiş bioaerosol örnekleme yöntem gösterir. Bu sistemde, anyon Satım reçine bioaerosols sıvı sıkışma tabanlı hava örnekleme cihazları olumsuz ücret virüslerin etkili yoğunlaşması ile birleştirilmiştir. Böylece, reçine bioaerosol örnekleme akışındaki bir ek konsantrasyon adım olarak hizmet vermektedir. Nükleik asit ayıklama viral parçacıkların sonra doğrudan doğruya--dan anyon Satım reçine elde edilen örnek moleküler analizleri için uygun ile gerçekleştirilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir ölçüye göre bioaerosol odası virüs yüklü bioaerosols çevre koşulları ve sıcaklık, nem gibi çevresel değişkenleri sürekli izlenmesi için izin çeşitli altında üretebilecek açıklar, Rüzgar hızı ve aerosol kitle konsantrasyon. Bu iletişim kuralını kullanan ana avantajı viral algılama, duyarlılık arttı değiştirilmemiş bir geleneksel sıvı darbe ölçer için doğrudan karşılaştırma yoluyla değerlendirildi gibidir. Diğer avantajı çeşitli olumsuz ücret virüsler, düşük maliyetli anyon Satım reçine (~$0.14 örnek başına) ve kullanım kolaylığı konsantre potansiyeline içerir. Ve potansiyel olarak sıvı örnekleme arabellek getirilmesi ihtiyacını darbe ölçer içinde kullanılan dezavantajları infektivite reçine adsorbe viral parçacıkların değerlendirmek için bu protokolü yetersizliği içerir.

Giriş

Bu yöntemin amacı olumsuz ücret virüslerden bioaerosols moleküler algılama kolaylaştırmak için bir son derece hassas bioaerosol örnekleme platform sağlamaktır. Mikroorganizmalar, viral parçacıkların, dahil olmak üzere bioaerosols içinde zaman1uzun süre hayatta kalabilir. Bioaerosols nispeten uzun mesafelerde seyahat ve canlılığı ve infektivite, soğutma kuleleri etkilenen kişilerden 6 km mesafede yer alan sanayi kökenli lejyonerler'hastalığı salgını kanıtladığı gibi korumak ve 18 ölümlerin2' de sonuçlandı. Bioaerosols tarafından aracılı insanlara virüslerin dolaylı iletim birden fazla ayarlarında oluşabilir ve norovirus salgınlar okullar ve restoranlar3,4için kanıtlanmıştır. Benzer şekilde, bioaerosol iletim virüslerin domuz ve tavuk çiftlikleri, tarım ayarları gibi üretim imkanları5, arasındaki virüslerin hareketinde önemli bir faktör olarak kabul ediliyor bu bulaşma yolları ile meydana gelebilir 6 , 7 , 8 , 9.

Virüs yüklü bioaerosols etkili örnekleme sağlar hızlı teşhis ve hazırlık salgını önleme, iyileşme için hangi H5 canlı hayvan bioaerosols üzerinden bir virüs algılandı grip pazarlar Çin'gösteriler gösterildiği gibi ve Amerika Birleşik Devletleri10,11. Geçerli bioaerosol örnekleme teknolojileri farklı parçacık yakalama ilkeleri bir dizi içerir ve geniş impingers, siklonlar, kırıcılar ve filtreler12kategorize edilebilir. Etraflıca tüm avantajları kapsayacak şekilde bu protokol kapsamında ve bu platformlar bioaerosols virüslerden örnekleme için dezavantajları dışındadır; Ancak, bu örnekleme aygıtlar çoğunluğu virüs ve bacteriophages13koleksiyonu için optimize edilmiştir değil ki belirtilebilir. Ayrıca, viral parçacıkların infektivite türden, sıvı impingers viral infektivite aygıt öyle aynı derecede sağlam kırıcılar veya filtreler14örnekleme daha etkili bir şekilde korumak için kabul ile etkilenir. Ancak, sıvı sıkışma dezavantaj bir virüs içinde nispeten büyük miktarda (genellikle ≥20 mL) sıvı koleksiyonu gemi içinde toplanan çünkü oluşan hedef seyreltme etkisi olduğunu. Bir diğer önemli dezavantajı parçacıklar konsantre sıvı impingers suboptimal verimliliğini içerir < boyutu15dakika sonra 0.5 µM. Ancak, immobilizasyon-ebilmek arttırmak viral nükleik asitler ve viral infektivite16,17korunması gibi yakalama verimliliği bu cihazların üzerinde katı matrisler, immobilizasyon tarafından geliştirilebilir.

Biz daha önce anyon Satım reçine yakalama ve virüslere karşı sıvı matrisler F-RNA bacteriophages, Hepatit A virüsü, insan adenovirus ve Rotavirüs18,19 da dahil olmak üzere, konsantrasyon için etkili bir araç olduğunu göstermiştir ,20. Üretici tarafından tanımlandığı gibi bu çalışmada kullanılan anyon Satım reçine macroreticular polistren güçlü temel anyon Satım reçine içinde functionalized kuaterner Amin grupları aracılık cazibe ve anyon sıvı orta21 yakalanması olduğunu . Sonuç olarak, anyon Satım reçine virüsler birçok enterik virüs, grip virüsleri ve diğer virüsler genel ve hayvan sağlığı için ilgili de dahil olmak üzere net negatif yüzey ücretleri ile yakalamak için bekleniyor.

Geçerli protokol anyon Satım reçine sıvı darbe ölçer için ek içerir. Bu sistemde, reçine için viral parçacıkların darbe ölçer sıvı içinde yakalanan bir ikincil konsantrasyon adım olarak hizmet vermektedir. Nükleik asitler sonra doğrudan küçük miktarlar, konsantre bir örnek için moleküler analiz sağlayan eluted. Böylece, bu yöntemin ana avantajı öncelikle numune hacmi azalma ile viral algılama duyarlılık gelişmedir. Ayrıca, nedeniyle doğal belirsiz yakalama olumsuz ücret virüslerin yöntemi muhtemeldir çok sayıda ilgi virüs tespiti için uygulanabilir. Burada, yöntem aşı suşları A tipi ve B tipi grip virüsleri ve FRNA coliphage MS2 için (MS2) gösterilmiştir. Bu virüsler daha sonra yukarıda açıklanan22standart qRT-PCR deneyleri kullanarak tespit edilir. Son nokta Kullanıcı çünkü bu yöntem yerine zorluklarla karşılaşmaya beklemek değil şu an mevcut olan için değişiklikleri ekipman bioaerosol örnekleme ve analiz geleneksel akışını büyük kesintileri teşkil etmez.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Kurulum Bioaerosol odası (bkz. Şekil 2)

  1. 0,01 M fosfat tamponlu tuz, pH 7.5 (PBS) 20 mL ile sıvı impingers ön yük.
    1. Anyon Satım reçine 0.5 g ekleyin ve PBS bir denetim olarak hizmet veren başka bir sıvı darbe ölçer ile sıvı impingers birinin içinde askıya alma.
  2. Paralel kelepçe standları Nebulizatör karşı karşıya aerosol alıcılar ile kullanarak bioaerosol odası içinde pozisyon sıvı impingers.
    Not: Ek ayrıntı için bkz: Şekil 2 .
  3. Kitle bioaerosol konsantrasyon (mg/m3) ölçmek için sıvı impingers yakınındaki bir doğrudan okumak aerosol monitör ortak bulun.
  4. Ek doğrudan okuma araçları (iç hava kalitesi monitör ve termal Anemometre) ortak bulun sıcaklık gibi ortam değişkenleri izlemek için sıvı impingers yakınındaki bağıl nem ve rüzgar hızı, içinde bioaerosol odası.
  5. Aksiyel fanlar aerosol karıştırma kolaylaştırmak için bioaerosol odası köşelerinde çalıştırın.
    Not: Aksiyel fanlar sabit bir hızda çalıştırmak ve ayarlanabilir değildir.

2. model Bioaerosolization deneyler (bkz. Şekil 3)

  1. Seri, 10 kat dilutions MS2 bakteriyofaj ve grip aşısı için istenen fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) konsantrasyonlarda gerçekleştirin.
    Not: burada, Yöntem 103.5 FFU/mL türü A ve B grip virüsü aşı suşları ve 10 göstermek için5 PFU/mL MS2 bakteriyofaj kullanılmaktadır. İnocula için titreleri belirlemek için bacteriophages Escherichia coli HS (pFamp) R yayılır ve yukarıda açıklanan20numaralandırılır. Ticari aşı dört canlı zayıflatılmış grip virüs suşları bilinen miktarda içerir, iki grip virüsleri ve floresan odak birimleri veya FFU bulunan iki B tipi grip virüsleri yazın.
  2. İnocula 6-jet çarpışma Nebulizatör cam kap içinde 100 mL PBS viral parçacıkların istenen konsantrasyonları süspansiyonlar oluşturarak hazırlamak ve özel bioaerosol odası içinde yükleyin.
  3. Bioaerosol odası, sıcaklık, bağıl nem oranı %, karbondioksit konsantrasyonu, gibi içinde değişkenleri ölçmek ve rüzgar hızı (Aksiyel fan kullanılarak oluşturulan) araçları başlatın. Yolu tarif etmek-okuma aerosol monitör bioaerosol odası içinde kitle konsantrasyon izlemek ve içinde ve denemeler arasında tutarlılık için kullanın.
  4. Bioaerosol odası mühür ve Hava HEPA filtre ile 10 min için tasfiye.
  5. Filtre uygulanmış, Kuru hava 6.9 kPa işletim Nebulizatör teslim.
  6. Bir hedef konsantrasyonu (via Nebulizatör) viral bioaerosols her bioaerosol odasında deneme oluşturmak. Bu gösteri için bioaerosols 5 mg/m3 bir konsantrasyon ile oluşturulur.
  7. Aerosol hedef kitle konsantrasyonu ulaşıldığında nebulization kes.
  8. Bir hava örnekleme pompa debisi 12.5 L/dak bir birincil akış standart ses örnekleme tutarlılık sağlamak için önce ve her örnekleme olayından sonra kullanarak kuralları kalibrasyon için kalibre sıvı her darbe ölçer için çalıştırmak. Tedarik seyreltme Nebulizatör bulunan bir HEPA filtre satırını kullanarak hava ve sabit basınç odasında korumak.
  9. Aktif bioaerosol odası atmosfer 500 L örnek başına bir örnekleme hacmi elde etmek için 40 dk süreyle örnek.
    Not: Bioaerosol 1000 L örnekleme için örnekleme 40dakika 12.5 L/dk ile paralel iki pompa için izin verir. Böylece, deney bitiminde bu bioaerosol odasında mevcut hava çoğunluğu örneklenmiş ve çevre yolu ile bir HEPA filtre sistemi içine serbest olduğunu bekleniyor. Bu parçacık konsantrasyonu düşüş olduğunu göstermiştir. Sonrası deneme, % 10 ev çamaşır suyu ve % 70 etanol ile yüzeyleri dekontamine. Göstergeler bu gösteride kullanılır; Ancak, patojen organizmalar bu sistemde kullanılan biliniyorsa, ek Biyogüvenlik önlemleri gerektiğinde uygulanabilir.

3. nükleik asit çıkarma ve qRT-PCR algılama

  1. Nükleik asitler doğrudan doğruya--dan anyon Satım reçine ve sıvı impingers içinde kullanılan sıvı gelen karşılaştırmalı amaçlar için izole et. Bu örnekte, bir RNA izolasyon yordam anlatılan ama benzer bir protokol DNA virüsleri için kullanılabilir.
    1. Anyon Satım reçine nükleik asit izolasyon.
      1. Tüm sıvı darbe ölçer anyon Satım reçine içeren sıvı steril 50 mL konik tüp aktarın.
      2. Reçine yerleşmek izin ve yavaş yavaş anyon Satım reçine sıvı örnekten dikkatle boşaltmak. 1 mL pipet ipucu tüm geri kalan sıvı anyon Satım reçine kaldırmak için kullanın.
      3. Bir viral RNA izolasyon kiti, taşıyıcı RNA doğrudan anyon Satım reçine içeren viral lizis arabelleği 560 µL ekleyin ve periyodik karıştırma ile Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
      4. 1 mL pipet ucu kullanarak Aktarım viral lysate (viral lizis arabellek) steril 1,5 ml konik tüp ve RNA ile devam kullanarak bir viral RNA izolasyon yalıtım kiti ( Tablo malzemelerigörmek) üretici yönergelerine uygun olarak hariç RNA toplam hacmi 60 µL elüsyon arabelleği içinde eluted.
    2. Nükleik asit izolasyon sıvı impingers.
      1. Sıvı örneği 140 µL steril 1,5 mL konik tüp içine pipet ve RNA izolasyon viral RNA izolasyon kiti toplam hacmi 60 µL elüsyon arabelleği içinde RNA eluting dışında üretici yönergelerine uygun olarak kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
        Not: 140 µL burada bir tek adım hazırlanmasında kullanılan belirli viral RNA izolasyon kiti ile işlenmiş en büyük örnek birimdir.
  2. QRT-PCR MS2 ve influenza A ve B virüsleri, yukarıda açıklanan23,24olarak algılanmasını gerçekleştirir. Bu gösteride, nükleik asit eluates 5 µL qRT-PCR için kullanılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 bioaerosols sıvı tabanlı impingers reçine eklenmesi ile üzerinden ücret tabanlı yakalama virüslerin arkasındaki ilke gösterir. Şekil 2 özel olarak oluşturulmuş bioaerosol odası kurulumu gösterir. Şekil 3 kloroformu deney ve önlemler kalite kontrolü sağlamak için ayarlama adımları açıklanır. Şekil 4 bioaerosols yakalanan olumsuz ücret ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı değiştirilmiş sıvı impingers kullanarak bioaerosols hassas viral yakalama için bir yöntem özetliyor. Yöntem algılama ve bioaerosols viral yük miktar için optimize edilmiştir. Burada gösterilen belirli değişiklik anyon Satım reçine ortak bir sıvı darbe ölçer içinde bulunan sıvı için ek içerir. Santrifüjü, filtrasyon ve yağış tabanlı yöntemleri gibi diğer örnek işleme teknikleri böyle bir avantaj sağlamaz, ancak bu yöntem aşağı akım örnek işleme, sadeliği ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser CDC/NIOSH yüksek ovalar Intermountain merkezi tarımsal sağlığı ve güvenliği (5U54OH008085) için ve Colorado Bioscience keşif değerlendirme hibe programı (14BGF-16) fon tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)American Type Culture CollectionATCC 15597-B1
FluMist QuadrivalentAstraZenecaContact manufacturerViral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195
Primers and probesIntegrated DNA TechnologiesNA
0.2 µM sterile filterNANA
1 L pyrex bottles or equivalentNANA
1 mL pipet tipsNANA
1 mL pipettorNANA
50 mL serological pipetNANA
PCR tubesNANA
Pipet-aid or equivalentNANA
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52904
QuantiTect Probe RT-PCR KitQiagen204443
Amberlite IRA-900 chloride formSigma-Aldrich216585-500G
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK
Water (molecular biology grade)Sigma-AldrichW4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge TubesThermoFisher13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge TubesThermoFisher05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROXThermoFisher11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass setSKC Inc.225-9593
Vac-u-Go sample pumpsSKC Inc.228-9695
Collison nebulizer (6-jet)BGI Inc.NA
HEPA capsulePALL12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554TSI Inc.NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-ATSI Inc.NA
SidePak AM510 personal aerosol monitorTSI Inc.NA
Bioaerosol chamberNANA

Referanslar

  1. Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
  2. Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
  3. Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
  4. Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
  5. Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444(2013).
  6. Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
  7. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
  8. Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401(2015).
  9. Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
  10. Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
  11. Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
  12. Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
  13. Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121(2017).
  14. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
  15. Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
  16. Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
  17. Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
  18. Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
  19. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
  20. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
  21. Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
  22. Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
  23. Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
  24. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
  25. Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
  26. Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
  27. Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
  28. Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
  29. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 138Bioaerosolsvir s toplama y ntemlerianyon Sat m re inebioaerosol odastan lamaqRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır