Détection des virus de bioaérosols à l’aide de résine échangeuse d’anions

Résumé

Un anion exchange résines méthode, adaptée au liquide impingement base bioaérosols prélèvement d’échantillons de virus est démontrée. Lorsqu’il est couplé avec la détection moléculaire en aval, la méthode permet une détection facile et sensible des virus de bioaérosols.

Résumé

Ce protocole illustre une méthode d’échantillonnage personnalisées aux bioaérosols de virus. Dans ce système, résine échangeuse d’anions est couplé avec dispositifs d’échantillonnage atmosphérique impingement liquide pour la concentration efficace des virus charge négative de bioaérosols. La résine sert donc, une étape de concentration supplémentaire du flux de travail d’échantillonnage aux bioaérosols. Extraction des acides nucléiques des particules virales est ensuite exécutée directement à partir de la résine échangeuse d’anions, avec l’échantillon qui en résulte adapté aux analyses moléculaires. De plus, ce protocole décrit une chambre aux bioaérosols sur mesure capable de générer des bioaérosols contenant des virus sous une variété de conditions environnementales et permettant une surveillance continue des variables environnementales comme la température, humidité, Vitesse du vent et la concentration massique en aérosol. Le principal avantage de l’utilisation de ce protocole est une sensibilité accrue de détection virale, telle qu’évaluée par comparaison directe avec un impacteur liquide conventionnel non modifié. D’autres avantages incluent la possibilité de concentrer des divers virus charge négative, le faible coût de résine échangeuse d’anions (~$0.14 par exemple) et la facilité d’utilisation. Les inconvénients incluent l’incapacité du présent protocole pour évaluer l’infectivité des particules virales adsorbés à la résine, et éventuellement la nécessité pour l’optimisation de la mémoire tampon de liquide d’échantillonnage utilisées au sein de l’impacteur.

Introduction

Le but de cette méthode est de fournir une plate-forme d’échantillonnage très sensibles aux bioaérosols afin de faciliter la détection moléculaire des virus charge négative de bioaérosols. Micro-organismes, y compris des particules virales, peuvent survivre en bioaérosols pendant de longues périodes de temps¹. Bioaérosols peut se déplacer sur des distances relativement longues et maintenir la viabilité et infectiosité, comme en témoigne une épidémie de légionellose qui proviennent de l’industriel situés à une distance de 6 km de personnes touchées de tours de refroidissement et abouti à 18 morts,². Transmission indirecte du virus aux humains médiées par les bioaérosols peut se produire dans divers milieux et a été démontrée pour les éclosions de norovirus dans les écoles et restaurants^3,4. De même, aux bioaérosols transmission du virus peut se produire dans des milieux agricoles telles que dans les élevages de porcs et la volaille, avec cet itinéraire de transmission étant considéré comme un facteur majeur dans la circulation du virus entre les installations de production^{5, 6 , 7 , 8 , 9}.

L’échantillonnage efficace des bioaérosols contenant des virus permet pour l’amélioration des diagnostics rapides et de la protection pour la prévention de l’épidémie, comme indiqué dans les démonstrations dans laquelle H5 grippe A virus ont été détectés de bioaérosols dans l’animal vivant commercialise en Chine et le Aux États-Unis,^10,11. Les technologies actuelles de l’échantillonnage aux bioaérosols impliquent un certain nombre de principes de capture des particules différentes et peuvent être classés dans les impacteurs, cyclones, frappe et filtres¹². Il n’est pas le champ d’application du présent protocole pour couvrir exhaustivement tous les avantages et les inconvénients de ces plateformes pour prélèvement d’échantillons de virus de bioaérosols ; Cependant, on peut affirmer que la majorité de ces dispositifs d’échantillonnage n’ont pas été optimisée pour la collection de virus et les bactériophages¹³. En outre, infectiosité des particules virales est souvent négativement affectée, avec des impacteurs liquides censées maintenir l’infectivité virale plus efficacement que l’échantillonnage des périphériques tels que les impacteurs ou filtres solides¹⁴. Cependant, un inconvénient de l’impingement liquide est l’effet de dilution de cible, qui se produit parce que les virus sont rassemblés dans des quantités relativement importantes (en général ≥ 20 mL) de liquide dans le récipient de collecte. Un autre inconvénient important implique l’efficacité sous-optimale des impacteurs liquides pour concentrer les particules < 0,5 µM en taille¹⁵. Cependant, l’efficacité de ces dispositifs de captage peut être améliorée par immobilisation sur matrices solides, comme l’immobilisation peut améliorer la préservation des acides nucléiques viraux et l’infectivité virale^16,17.

Nous avons démontré précédemment que la résine échangeuse d’anions est un outil efficace pour la capture et la concentration de virus à partir de matrices liquides, y compris les bactériophages, virus de l’hépatite A, adénovirus humain et antirotavirus^{18,19 F-RNA ,},²⁰. Tel que défini par le fabricant, la résine échangeuse d’anions utilisée dans ce travail est une résine d’échangeuse d’anions base solide en polystyrène macroréticulées dans laquelle fonctionnalisées amines quaternaires groupes attraction médiate et capture des anions dans un milieu liquide²¹ . Par conséquent, la résine échangeuse d’anions devrait capturer les virus avec des charges de surface net négatif, y compris beaucoup de virus entériques, virus de la grippe et autres virus touchant la santé publique et animale.

Le protocole actuel implique l’ajout de résine échangeuse d’anions d’un impacteur liquid. Dans ce système, la résine est une étape de concentration secondaire des particules virales capturé dans le liquide de l’impacteur. Acides nucléiques peut alors être directement éluées par petites quantités, prévoyant un échantillon concentré des analyses moléculaires. Ainsi, le principal avantage de cette méthode est l’amélioration de la sensibilité de détection virale, principalement par le biais de réduction du volume de l’échantillon. En outre, en raison de la capture de non-spécifiques inhérente des virus de charge négative, la méthode est probablement applicable pour la détection d’un grand nombre de virus d’intérêt. Ici, la méthode est démontrée pour les souches vaccinales du virus de l’influenza de type B et de type A et les coliphages FRNA MS2 (MS2). Ces virus sont détectés ultérieurement à l’aide de dosages standard qRT-PCR comme décrit précédemment²². L’utilisateur point final ne devrait pas s’attendre à rencontrer des difficultés dans l’exécution de cette méthode, car les modifications à l’heure actuelle équipement ne constituent pas des perturbations majeures au flux classique de bioaérosols d’échantillonnage et d’analyse.

Protocole

1. installation de la chambre aux bioaérosols (voir Figure 2)

1. Précharger les impacteurs liquides avec 20 mL de 0,01 M phosphate buffered saline, pH 7,5 (PBS).
   1. Ajouter 0,5 g de résine échangeuse d’anions et suspendre dans du PBS de l’un des impacteurs liquides, avec un autre impacteur liquide agissant comme un contrôle.
2. Impacteurs liquides de position en parallèle dans la chambre aux bioaérosols, à l’aide de supports de pince avec anses aérosol face le nébuliseur.
   Remarque : Voir la Figure 2 pour plus de détails.
3. Co-implanter un moniteur direct-lire aérosol près des impacteurs liquides pour mesurer la concentration en masse (mg/m³) d’aux bioaérosols.
4. Co-implanter instrumentation direct-lecture supplémentaires (air intérieur qualité thermique et moniteur anémomètre) près des impacteurs liquides pour surveiller les variables environnementales, telles que la température, humidité et vent vitesse, au sein de la chambre aux bioaérosols.
5. Exécution des ventilateurs axiaux dans les coins de la chambre aux bioaérosols pour faciliter le mélange des aérosols.
   Remarque : Les ventilateurs axiaux rouler à une vitesse fixe et ne sont pas réglables.

2. modèle Bioaerosolization expériences (voir Figure 3)

1. Effectuer la série, 10 fois les dilutions de MS2 phage et grippe vaccin aux concentrations souhaitées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   Remarque : Pour démontrer la méthode ici, 10^3.5 FFU/mL de type A et B virus vaccin souches d’influenza et 10⁵ UFP/mL du bactériophage MS2 sont utilisés. Pour déterminer les titres pour les inoculums, bactériophages sont propagées de Escherichia coli HS (pFamp) R et énumérés comme décrit précédemment²⁰. Le vaccin commercial contient des quantités connues de quatre souches de virus vivants atténués grippe, deux type un virus de la grippe et deux virus de l’influenza de type B, exprimées en unités de discussion fluorescent ou FFU.
2. Préparer des inoculums dans le récipient de verre d’un nébuliseur jet 6 collisions en créant des suspensions de désiré concentrations de particules virales dans 100 mL de PBS et installer dans la chambre aux bioaérosols personnalisé.
3. Initier des instruments pour mesurer les variables au sein de la chambre aux bioaérosols, comme la température, le % d’humidité relative, la concentration de dioxyde de carbone et par un vent (généré à l’aide d’un ventilateur axial). Utiliser un moniteur de lecture directe aérosol pour suivre la concentration en masse au sein de la chambre aux bioaérosols et pour établir la cohérence au sein et entre les essais.
4. Sceller la chambre aux bioaérosols et purger pendant 10 min avec de l’air filtré HEPA.
5. Livrer l’air filtré, séché sur le nébuliseur fonctionnant à 6,9 kPa.
6. Générer une concentration cible de bioaérosols virale (via nébuliseur) dans chaque chambre aux bioaérosols du procès. Pour cette démonstration, bioaérosols avec une concentration de 5 mg/m³ sont générés.
7. Une fois que la concentration massique de cible de l’aérosol a été atteint, cesser de nébulisation.
8. Utiliser une pompe de prélèvement d’air pour chaque impacteur liquide qui a été étalonné à un débit de 12,5 L/min. conduite d’étalonnage avec une norme de débit principal avant et après chaque événement d’échantillonnage pour assurer l’uniformité dans volume de prélèvement. Dilution d’alimentation d’air en utilisant une ligne filtre HEPA située près du nébuliseur et maintenez une pression constante dans la chambre.
9. Activement, goûter l’atmosphère de chambre aux bioaérosols pour une durée de 40 min pour atteindre un volume d’échantillonnage de 500 L par exemple.
   Remarque : Échantillonnage pendant 40 min à 12,5 L/min avec deux pompes en parallèle permet d’échantillonnage de 1 000 L des bioaérosols. Ainsi, à la fin de l’expérience, il est prévu que la majorité de l’air présent dans l’hémicycle aux bioaérosols a été échantillonnée et rejetée dans l’environnement via un système de filtre HEPA. Ceci est démontré par la diminution de la concentration de particules. Après expérience, les surfaces sont décontaminés à l’aide de 10 % d’éthanol 70 % et de l’eau de Javel domestique. Les indicateurs sont utilisés dans cette démonstration ; Toutefois, si elle est connue des organismes pathogènes sont utilisés dans ce système, les mesures de biosécurité supplémentaires peuvent être exécutées selon les besoins.

3. acides nucléiques Extraction et qRT-PCR Detection

1. Isoler des acides nucléiques directement à partir de résine échangeuse d’anions et, aux fins de comparaison, le liquide utilisé dans les impacteurs liquides. Dans cet exemple, nous décrivons une procédure d’isolement de RNA, mais un protocole semblable pourrait être utilisé pour les virus à ADN.
   1. Isolement d’acide nucléique dans la résine échangeuse d’anions.
      1. Transférer la totalité du liquide contenant résine échange anionique de l’impacteur liquid dans un tube conique stérile de 50 mL.
      2. Laissez la résine s’installer et décanter lentement l’échantillon liquide de la résine échangeuse d’anions. Utiliser un embout de pipette de 1 mL pour retirer tout le liquide restant de la résine échangeuse d’anions.
      3. Partir d’un kit d’isolation RNA viral, ajouter 560 µL de tampon de lyse virale contenant du transporteur RNA directement à la résine échangeuse d’anions et incuber pendant 10 min à température ambiante avec mélange périodique.
      4. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, transférer le viral lysat (le tampon de lyse virale) à une conique stérile de 1,5 mL tube et aller de l’avant avec de l’ARN d’isolement à l’aide d’un ARN viral nécessaire (voir la Table des matières) conformément aux instructions du fabricant, sauf que l’ARN est élué dans un volume total de 60 µL de tampon d’élution.
   2. Acide nucléique indépendamment des impacteurs liquides.
      1. Distribuer 140 µL de l’échantillon liquide dans un tube conique stérile de 1,5 mL et effectuer des ARN en utilisant le kit d’isolement viral ARN conformément aux instructions du fabricant, à l’exception d’élution RNA dans un volume total de 60 µL de tampon d’élution.
         NOTE : 140 µL est le volume d’échantillonnage maximale qui peut être traité avec le kit isolement viral spécifique d’ARN employé ici en une seule étape préparation.
2. Effectuer qRT-PCR pour la détection de MS2 et influenza de type A et type B comme décrit précédemment^23,24. Dans cette démonstration, 5 µL des éluats acide nucléique sont utilisés pour qRT-PCR.

Résultats

Figure 1 illustre le principe qui sous-tend la capture axée sur la charge de virus de bioaérosols par l’inclusion de la résine dans les impacteurs base liquide. La figure 2 illustre la configuration de la chambre aux bioaérosols sur mesure. La figure 3 décrit les étapes nécessaires à la mise en place l’expérience aérosolisation et les mesures pour s’assurer le contrôle de la qualité...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour la capture virale sensible de bioaérosols en utilisant des impacteurs liquides mis à jour le. La méthode est optimisée pour la détection et la quantification de la charge virale dans les bioaérosols. La modification précise démontrée ici implique l’ajout de résine échangeuse d’anions à liquide contenue dans un impacteur liquid commun. Cette méthode a été développée pour sa simplicité dans le traitement de l’échantillon en aval, alors que les autres technique...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)	American Type Culture Collection	ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent	AstraZeneca	Contact manufacturer	Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195
Primers and probes	Integrated DNA Technologies	NA
0.2 µM sterile filter	NA	NA
1 L pyrex bottles or equivalent	NA	NA
1 mL pipet tips	NA	NA
1 mL pipettor	NA	NA
50 mL serological pipet	NA	NA
PCR tubes	NA	NA
Pipet-aid or equivalent	NA	NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit	Qiagen	204443
Amberlite IRA-900 chloride form	Sigma-Aldrich	216585-500G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Water (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher	13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher	14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher	05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX	ThermoFisher	11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set	SKC Inc.	225-9593
Vac-u-Go sample pumps	SKC Inc.	228-9695
Collison nebulizer (6-jet)	BGI Inc.	NA
HEPA capsule	PALL	12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554	TSI Inc.	NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A	TSI Inc.	NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor	TSI Inc.	NA
Bioaerosol chamber	NA	NA