Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

요약

음이온 교환 수 지 기반 방법, 바이러스의 충돌-기반 bioaerosol 샘플링 시연 액체에 적응 합니다. 다운스트림 분자 탐지와 결합 하면 메서드 bioaerosols에서 바이러스의 손쉬운 및 민감한 감지.

초록

이 프로토콜에서는 바이러스에 대 한 사용자 지정된 bioaerosol 샘플링 방법을 보여 줍니다. 이 시스템에서는, 음이온 교환 수 지에서 bioaerosols 부정 청구 바이러스의 효능 농도 액체 치는 행위 기반 공기 샘플링 디바이스와 결합 이다. 따라서, 수 지 bioaerosol 샘플링 워크플로에 추가 농도 단계 역할을 합니다. 바이러스 성 입자의 핵 산 추출 다음 결과 샘플 분자 분석에 대 한 적합 한 음이온 교환 수 지에서 직접 수행 됩니다. 또한,이 프로토콜 사용자 bioaerosol 챔버 다양 한 환경 조건과 환경 변수 온도, 습도, 등의 지속적인 모니터링에 대 한 허용 아래 바이러스 라덴 bioaerosols 생성할 수 설명 바람 속도, 고 졸 대량 농도입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여의 주요 장점은 수정 되지 않은 기존의 액체 임 핀 저를 직접 비교를 통해 평가 바이러스 탐지의 감도 증가입니다. 다른 장점은 집중 다양 한 부정 청구 바이러스, 음이온 교환 수 지 (샘플 당 ~$0.14), 및 사용의 용이성의 저렴 한 비용을 포함 합니다. 단점 수 지 흡착 바이러스 성 입자의 infectivity 평가이 프로토콜의 무 능력을 포함 하 고 액체 샘플링 버퍼의 최적화에 대 한 필요는 임 핀 저 내에서 사용 하는 잠재적으로.

서문

이 방법의 목적은 bioaerosols에서 부정 청구 바이러스의 분자 탐지를 촉진 하기 위하여 매우 중요 한 bioaerosol 샘플링 플랫폼을 제공. 미생물, 바이러스 성 입자를 포함 하 여 장시간 시간¹bioaerosols에서 살아남을 수 있습니다. Bioaerosols 비교적 긴 거리를 여행 하 고 생존 및 infectivity, 산업 영향 받은 개인에서 6 킬로미터의 거리에 있는 타워에서 Legionnaires' 질병의 발발에 의해 입증으로 유지 수 및 18 사망자²결과. 간접 전송 bioaerosols 중재 하는 인 간에 게 바이러스의 여러 설정에서 발생할 수 있으며 학교와 레스토랑^3,4노로바이러스 감염에 대 한 입증 되었습니다. 바이러스의 bioaerosol 전송의 생산 시설^5, 바이러스의 운동에 주요 요인으로 간주 되 고이 전송 경로와 마찬가지로, 돼지 및 가금류 농장에서와 같은 농업 설정에서 발생할 수 있습니다. ^{6 , 7 , 8 , 9}.

시위는 H5 독감 바이러스는 살아있는 동물에서 bioaerosols에서 발견 된 중국에서 시장 에서처럼 바이러스 라덴 bioaerosols의 효과적인 샘플링 신속한 진단 및 확산 방지를 위한 대비에 개선을 위한 수 고는 미국^10,11. 현재 bioaerosol 샘플링 기술을 다른 입자 캡처 원칙의 숫자를 포함 하 고 impingers, 사이 클론, impactors, 및 필터¹²에 광범위 하 게 분류 될 수 있다. 그것은 철저 하 게 모든 장점을 커버 하이 프로토콜의 범위와 bioaerosols;에서 바이러스의 샘플링에 대 한 이러한 플랫폼의 단점 그러나, 그것은 바이러스 및 살 균 소¹³의 컬렉션에 대 한 이러한 샘플링 장치의 대다수는 최적화 되지 진술 될 수 있다. 또한, 바이러스 성 입자의 infectivity은 종종 부정적인 영향을, 액체 impingers 바이러스 infectivity 샘플링 장치 고체 impactors 또는 필터¹⁴보다 더 효과적으로 유지 하는 것으로 간주와 함께. 그러나, 하나의 액체 충돌의 단점은 대상 희석 효과, 바이러스는 비교적 많은 양의 (일반적으로 ≥20 mL) 액체 수집 용기에 수집 때문에 발생 합니다. 또 다른 중요 한 단점은 집중 입자를 액체 impingers의 차선의 효율성 포함 < 0.5 µ M 크기¹⁵. 그러나, 이러한 장치의 캡처 효율 immobilization 바이러스 성 핵 산 바이러스 infectivity^16,17의 보존을 향상 시킬 수 있습니다으로 고체 행렬에 동원 정지에 의해 개선할 수 있습니다.

우리는 이전 음이온 교환 수 지 캡처 및 F-RNA 살 균 소, A 형 간염 바이러스, 인간 아 데 노비 루스, 고로^{18,19 포함 하 여 액체 매트릭스에서 바이러스의 농도 대 한 효과적인 도구입니다 증명 하고있다 ,20}. 제조 업체에 의해 정의 된 대로이 작품에서 음이온 교환 수 지는 기능성된 4 급 아민 그룹 중재 하십시오 매력 및 액체 매체²¹ 에서 음이온의 캡처 macroreticular 폴리스 티 렌 강한 기본 음이온 교환 수 지 . 따라서, 음이온 교환 수 지 그물 네거티브 표면 요금, 많은 장 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 다른 바이러스 관련 공공 및 동물 건강을 포함 하 여 바이러스를 캡처 예정 이다.

현재 프로토콜 액체 임 핀 저를 음이온 교환 수 지의 추가 포함 한다. 이 시스템에서 수 지 임 핀 저 액체에서 바이러스 성 입자에 대 한 보조 농도 단계 역할을 합니다. 핵 산 분자 분석에 대 한 집중된 샘플을 제공 하는 작은 볼륨에서 직접 eluted 수 다음. 따라서,이 방법의 주요 장점은 주로 샘플 볼륨 감소를 통해 바이러스 검출 감도에 개선 이다. 또한, 때문에 부정적인 충전 바이러스의 고유의 일반적인 캡처, 방법은 가능성이 많은 관심의 바이러스의 탐지를 위해 적용 가능한. 여기, 메서드는 백신 긴장의 유형 A와 B 형 인플루엔자 바이러스와 FRNA coliphage MS2 (MS2)에 대 한 보여 줍니다. 이러한 바이러스 그 후 앞에서 설명한²²로 표준 qRT-PCR 분석 실험을 사용 하 여 검색 됩니다. 끝점 사용자 때문에이 메서드를 수행에 문제가 발생할 것을 기대 하지 해야 수정 현재 기존 장비 bioaerosol 샘플링 및 분석의 기존 흐름에 주요 중단을 구성 하지 않습니다.

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프로토콜

1. Bioaerosol 챔버의 설치 ( 그림 2참조)

1. 사전에 0.01 M 버퍼링 인산 염 분, pH 7.5 (PBS)의 20 mL와 함께 액체 impingers 로드 합니다.
   1. 음이온 교환 수 지의 0.5 g을 추가 하 고 컨트롤 역할을 수행 하는 다른 액체 임 핀 저와 액체 impingers 중의 PBS 내 일시 중단.
2. 챔버 내부에 bioaerosol는 분무기를 직면 하는 어로 졸 후미와 클램프 스탠드를 사용 하 여 병렬로 위치 액체 impingers.
   참고: 추가 정보에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오.
3. 공동 직접 읽기 졸 모니터를 bioaerosol의 대량 농도 (mg/m³)을 측정 하 여 액체 impingers 가까이 찾습니다.
4. 추가적인 직접 읽기 계측 (실내 공기 질 모니터 및 열 풍속 계) 배치, 온도 등의 환경 변수를 모니터링 하는 액체 impingers 근처 상대 습도 바람 속도, 챔버 내에 bioaerosol.
5. 에 어로 졸의 혼합을 촉진 하기 위하여 bioaerosol 챔버의 모서리에 축 팬 들을 실행 합니다.
   참고: 축 팬 고정 속도로 실행 하 고는 조정 가능 하다.

2. 모델 Bioaerosolization 실험 ( 그림 3참조)

1. 시리얼, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 원하는 농도 MS2 살 균 소 및 인플루엔자 백신의 10 희석을 수행 합니다.
   참고: 여기, 10^3.5 : FFU/mL는 종류 A와 B 독감 바이러스 백신 긴장의와 10 메서드를 보여 주기 위해⁵ PFU/mL MS2 살 균 소의 활용 됩니다. Titers는 inocula에 대 한 결정, 살 균 소는 대장균 HS (pFamp) R에에서 전파 되며 앞에서 설명한²⁰으로 열거. 상용 백신 포함 알려진된 양의 4 라이브 감쇠 독감 바이러스 변종, 두 입력 인플루엔자 바이러스와 형광 초점 단위 또는: FFU 표현 두 B 형 인플루엔자 바이러스.
2. 100 mL PBS의에서 바이러스 성 입자의 원하는 농도의 정지를 만들어서 6 제트기 충돌 분무기의 유리 용기 내에서 inocula를 준비 하 고 사용자 지정 bioaerosol 챔버 내 설치.
3. 계측 변수 챔버 내에 bioaerosol, 온도, % 상대 습도, 이산화탄소 농도 등을 측정 하 고 바람 속도 (축 팬을 사용 하 여 생성)을 시작 합니다. 직접 읽기 졸 모니터를 사용 하 여 챔버 내에 bioaerosol 질량 농도 추적 하 고 시간과 실험 사이 일관성을 확립.
4. Bioaerosol 챔버를 밀봉 하 고 공기 HEPA 필터와 10 분 동안 제거.
5. 6.9 kPa에서 분무기에 필터링 된, 건조 공기를 제공 합니다.
6. 각 bioaerosol 챔버 시험 (nebulizer)를 통해 바이러스 bioaerosols의 대상 농도 생성 합니다. 이 데모 5 mg/m³ 의 농도와 bioaerosols 생성 됩니다.
7. 에 어로 졸의 대상 질량 농도 도달 하면 일단 nebulization을 중지 합니다.
8. 사용 하 여 기본 흐름 표준 각 샘플링 이벤트 전 / 후 볼륨 샘플링에 일관성을 보장 하는 행위 교정 12.5 L/분의 유량을 조정 되었습니다 각 액체 임 핀 저에 대 한 공기 샘플링 펌프를 작동 합니다. 공급 희석 HEPA 필터 라인 부근에 분무기를 사용 하 여 공기와 챔버에 일정 한 압력을 유지.
9. 적극적으로 샘플 당 500 L의 샘플링 볼륨을 달성 하기 위해 40 분의 기간에 대 한 bioaerosol 챔버 분위기를 샘플 합니다.
   참고: 동시에 두 개의 펌프와 12.5 L/분 40 분에 대 한 샘플링은 bioaerosol의 1000 L의 샘플링에 대 한 허용 됩니다. 따라서, 실험의 완료에 예상 된다 bioaerosol 약 실에 있는 공기의 대부분을 샘플링 하 고 HEPA 필터 시스템을 통해 환경으로 출시 되었습니다. 이 입자 농도 감소에 의해 입증 됩니다. 후 실험 표면 10% 가구 표 백제와 70% 에탄올으로 소독 된다. 표시기;이 데모에 사용 됩니다. 그러나, 알려진 병원 성 유기 체는이 시스템에 사용 됩니다, 추가 biosafety 조치 수 있습니다 구현 필요에 따라.

3. 핵 산 추출 및 qRT-PCR 검출

1. 음이온 교환 수 지에서 직접 하 고, 액체 impingers 내에서 사용 하는 액체에서 비교 목적을 위해 핵 산을 분리. 이 예제에서는 RNA 격리 절차 설명 하지만 비슷한 프로토콜 DNA 바이러스를 위해 사용 될 수 있습니다.
   1. 음이온 교환 수 지에서 핵 산 격리입니다.
      1. 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 음이온 교환 수 지를 포함 하는 액체의 액체 임 핀 저의 모두를 전송.
      2. 정착, 수 지 고 천천히 음이온 교환 수 지에서 액체 샘플을 가만히 따르다. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 음이온 교환 수 지에서 남은 액체의 모든을 제거.
      3. 바이러스 성 RNA 격리 키트에서 포함 하는 음이온 교환 수 지에 직접 캐리어 RNA 바이러스 성 세포의 용 해 버퍼의 560 µ L을 추가 하 고 정기적으로 혼합과 실 온에서 10 분 동안 품 어.
      4. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하는 바이러스 성 전송 lysate (바이러스 성 세포의 용 해 버퍼) 살 균 1.5 ml 원뿔 튜브와 RNA 계속 바이러스 성 RNA 격리를 사용 하 여 격리 키트 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라 제외 하 고 그 RNA는 eluted 차입 버퍼의 60 µ L의 전체 볼륨에.
   2. 핵 산 격리 액체 impingers에서.
      1. 살 균 1.5 mL 원뿔 튜브에 액체 샘플의 140 µ L 플라스틱 고 RNA 격리 차입 버퍼의 60 µ L의 전체 볼륨에 RNA를 방출 하는 것 제외 하 고 제조업체의 지침에 따라 바이러스 성 RNA 격리 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
         참고: 140 µ L은 단일 단계 준비에서 여기 고용 특정 바이러스 성 RNA 격리 키트와 함께 처리할 수 있는 최대 샘플 볼륨입니다.
2. 앞에서 설명한^23,24MS2 및 인플루엔자 A와 B 바이러스의 검출을 위한 qRT-PCR을 수행 합니다. 이 데모에서는 핵 산 있다의 5 µ L qRT-PCR에 사용 됩니다.

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결과

그림 1 에서 bioaerosols 액체 기반의 impingers 수 지의 포함을 통해 바이러스의 차지 기반 캡처의 뒤에 원리를 보여 줍니다. 그림 2 는 사용자 bioaerosol 챔버의 설치. 그림 3 에서는 aerosolization 실험 및 측정 품질 관리를 보장 하기 위해 설정에 관련 된 단계를 설명 합니다. 그림 4 는 qRT-PCR bio...

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토론

이 프로토콜에서 bioaerosols 수정된 액체 impingers를 사용 하 여 민감한 바이러스 캡처 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 탐지 및 정량화 bioaerosols에 바이러스 부하의 최적화 되어 있습니다. 여기 설명 하는 특정 수정 일반적인 액체 임 핀 저 안에 포함 된 액체에 음이온 교환 수 지의 추가 포함 한다. 이 메서드는 원심 분리, 여과, 강 수 기반 방법 등 다른 샘플 처리 기술 이러한 이점을 제공 하지 않는 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)	American Type Culture Collection	ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent	AstraZeneca	Contact manufacturer	Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195
Primers and probes	Integrated DNA Technologies	NA
0.2 µM sterile filter	NA	NA
1 L pyrex bottles or equivalent	NA	NA
1 mL pipet tips	NA	NA
1 mL pipettor	NA	NA
50 mL serological pipet	NA	NA
PCR tubes	NA	NA
Pipet-aid or equivalent	NA	NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit	Qiagen	204443
Amberlite IRA-900 chloride form	Sigma-Aldrich	216585-500G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Water (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher	13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher	14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher	05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX	ThermoFisher	11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set	SKC Inc.	225-9593
Vac-u-Go sample pumps	SKC Inc.	228-9695
Collison nebulizer (6-jet)	BGI Inc.	NA
HEPA capsule	PALL	12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554	TSI Inc.	NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A	TSI Inc.	NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor	TSI Inc.	NA
Bioaerosol chamber	NA	NA