Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

Zusammenfassung

Ein Anion Austausch Harz-basierte Methode, angepasst an Flüssigkeit, die Impingement-basierte Bioaerosol Probenahme von Viren nachgewiesen wird. Kombination mit nachgeschalteter molekulare Erkennung ermöglicht die Methode facile und empfindlichen Nachweis von Viren von bioaerosolen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt eine angepasste Bioaerosol Sampling-Methode für Viren. In diesem System ist Anion Austausch Harz mit flüssigen Impingement-basierten Air Probenahmegeräte für wirksame Konzentration von negativ geladenen Viren von bioaerosolen gekoppelt. So dient das Harz als zusätzliche Konzentration Schritt im Workflow Bioaerosol Probenahme. Nukleinsäure-Extraktion der viralen Partikel erfolgt dann direkt aus dem Anion Austausch Harz, mit der sich daraus ergebenden Probe für Molekulare Analysen geeignet. Dieses Protokoll beschreibt weiter, eine Custom-Built Bioaerosol Kammer erzeugen Virus beladenen Bioaerosole unter verschiedensten Umweltbedingungen und damit für die kontinuierliche Überwachung der Umgebungsvariablen wie Temperatur, Feuchtigkeit, Windgeschwindigkeit und Aerosol Massenkonzentration. Der wesentliche Vorteil der Verwendung dieses Protokolls ist erhöhte Empfindlichkeit des Viren-Erkennung, da mittels direkter Vergleich zu einer unveränderten konventionelle flüssige Ausbeute bewertet. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, diverse negativ geladene Viren, die niedrigen Kosten der Anion Austausch Harz (~$0.14 pro Probe) und Benutzerfreundlichkeit zu konzentrieren. Nachteile sind die Unfähigkeit dieses Protokolls, Infektiosität von Harz adsorbiert Viruspartikel zu bewerten, und möglicherweise die Notwendigkeit zur Optimierung des Puffers flüssige Probenahme verwendet innerhalb der Ausbeute.

Einleitung

Der Zweck dieser Methode ist eine hochsensible Bioaerosol Probenahme Plattform zur molekularen Erkennung von negativ geladenen Viren von bioaerosolen Erleichterung bieten. Mikroorganismen, einschließlich Viruspartikel, können über einen längeren Zeitraum der Zeit¹in bioaerosolen überleben. Bioaerosole können über relativ große Entfernungen reisen und Lebensfähigkeit und Infektiosität, zu erhalten, wie ein Ausbruch der Legionärskrankheit belegt, die aus industriellen Kühltürme befindet sich in einer Entfernung von 6 km von den betroffenen Personen stammen und 18 Todesfälle²führte. Indirekter Übertragung von Viren auf den Menschen vermittelt durch Bioaerosole für Norovirus Ausbrüche in Schulen und Restaurants^3,4nachgewiesen und kann in mehreren Einstellungen auftreten. In ähnlicher Weise kann Bioaerosol Übertragung von Viren in landwirtschaftlichen Einstellungen wie z. B. bei Schweinen und Geflügel betrieben, mit dieser Übertragungsweg als ein wichtiger Faktor in der Bewegung von Viren zwischen Produktion Einrichtungen^5, auftreten. ^{6 , 7 , 8 , 9}.

Effektive Probenahme von bioaerosolen Virus beladenen ermöglicht eine Verbesserung der Schnelldiagnostik und Bereitschaft zur ausbruchsprävention, wie bei Demonstrationen gezeigt welche H5, Grippe eine Viren wurden von bioaerosolen im lebenden Tier entdeckt in China Märkten und die USA^10,11. Aktuellen Bioaerosol-Sampling-Technologien beinhalten eine Reihe von verschiedenen Teilchen erfassen Prinzipien und in Impingers, Zyklone, Impaktoren und Filter¹²breit kategorisiert werden können. Es sprengt den Umfang dieses Protokolls erschöpfend decken alle Vorteile und Nachteile dieser Plattformen für die Probenahme von bioaerosolen Viren; Allerdings ist festzuhalten, dass der Großteil dieser Probenahmegeräte für die Sammlung von Viren und Bakteriophagen¹³nicht optimiert wurden. Darüber hinaus ist Infektiosität der Viruspartikel oft negativ beeinflusst, mit flüssigen Impingers als virale Infektiosität effektiver als sampling-Geräte wie solide Impaktoren oder Filter¹⁴pflegen. Ein Nachteil des flüssigen Impingement ist jedoch der Verwässerungseffekt Ziel, die tritt auf, weil Viren in relativ großen Mengen (in der Regel ≥20 mL) Flüssigkeit in den Sammelbehälter aufgefangen werden. Ein weiterer wichtiger Nachteil beinhaltet die suboptimale Effizienz des flüssigen Impingers Partikel konzentrieren < 0,5 µM in Größe¹⁵. Capture Effizienz dieser Geräte kann jedoch durch Immobilisierung auf festen Matrizen verbessert werden, wie Immobilisierung Erhaltung der viralen Nukleinsäuren und virale Infektiosität^16,17verbessern kann.

Wir haben bereits gezeigt, dass Anion Austausch Harz ein wirksames Instrument für die Erfassung und die Konzentration der Viren aus flüssigen Matrizen ist, einschließlich F-RNA Bakteriophagen, Hepatitis A-Virus, menschliche Adenovirus und Rotaviren^{18,19 ,20}. Wie vom Hersteller definiert, ist das Anion Austausch Harz genutzt in diesem Werk ein Macroreticular Polystyrol starke base Anion Austausch Harz in der funktionalisierten quartäres Amin Gruppen vermitteln Attraktion und Erfassung von Anionen in einer flüssigen Mittel²¹ . Infolgedessen soll das Anion Austausch Harz Viren mit Net-Negative Oberfläche Gebühren, einschließlich viele enterischen Viren, Influenza-Viren und andere Viren relevant für die Gesundheit von Mensch und Tier zu erfassen.

Das aktuelle Protokoll beinhaltet die Zugabe von Anion Austausch Harz zu einem flüssigen Ausbeute. In diesem System dient das Harz als eine sekundäre Konzentration Schritt für virale Partikel in die Ausbeute Flüssigkeit gefangen genommen. Nukleinsäuren können dann direkt in kleinen Mengen, bietet eine konzentrierte Probe für Molekulare Analysen eluiert werden. Der Hauptvorteil dieser Methode deshalb die Verbesserung der viralen Nachweisempfindlichkeit, vor allem durch Verringerung des Volumens der Probe. Darüber hinaus aufgrund der inhärenten unspezifische Einnahme negativ geladene Viren, die Methode ist wahrscheinlich für die Erkennung einer Vielzahl von Viren von Interesse. Hier wird die Methode für Impfstämme Typ A und Typ B Influenza-Viren und die FRNA Coliphage MS2 (MS2) demonstriert. Diese Viren sind anschließend mit standard qRT-PCR-Assays als zuvor beschriebenen²²nachgewiesen. Der Endpunkt-Benutzer sollten nicht erwarten, Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Methode, da Änderungen an der aktuell vorhandenen Geräte sind keine größere Störungen zu den herkömmlichen Fluss Bioaerosol Probenahme-und Analysemethoden.

Protokoll

1. Setup der Bioaerosol Kammer (siehe Abbildung 2)

1. Vorspannung der flüssigen Impingers mit 20 mL 0,01 M Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5 (PBS).
   1. 0,5 g Anion Austausch Harz und unterbrechen Sie innerhalb der PBS eines flüssigen Impingers, mit einer anderen Flüssigkeit Ausbeute als Kontrolle dienen.
2. Lage flüssige Impingers parallel in der Bioaerosol-Kammer mit Klammer steht mit Aerosol Buchten mit Blick auf den Zerstäuber.
   Hinweis: Siehe Abbildung 2 für weitere Details.
3. Zusammenlegung eines direkten lesenden Aerosol Monitors in der Nähe der flüssigen Impingers Konzentration (mg/m³) von dem Bioaerosol messen.
4. Zusammenlegung von zusätzlichen direkten lesenden Instrumente (Raumluft Qualität Monitor und thermische Anemometer) in der Nähe der flüssigen Impingers Umgebungsvariablen wie Temperatur, Überwachung der relativen Luftfeuchtigkeit und Wind zu beschleunigen, innerhalb der Bioaerosol-Kammer.
5. Führen Sie Axialventilatoren in den Ecken der Bioaerosol Kammer zur Erleichterung des Aerosols mischen.
   Hinweis: Axialventilatoren mit einer festen Geschwindigkeit laufen und sind nicht verstellbar.

2. Bioaerosolization Modellversuche (siehe Abbildung 3)

1. Seriell, 10-divisibel Verdünnungen von MS2 Bakteriophagen und Influenza-Impfstoff zur gewünschten Konzentrationen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durchführen.
   Hinweis: Werden die Methode hier, 10^3,5 FFU/mL von der Typ A und B Influenza-Impfstoff Virusstämme und 10 zeigen⁵ PFU/mL von der Bakteriophage MS2 genutzt. Um Titer für die Impfkulturen festzustellen, sind Bakteriophagen in Escherichia coli HS (pFamp) R propagiert und wie zuvor beschrieben²⁰aufgelistet. Der kommerziellen Impfstoff enthält bekannte Mengen von vier live abgeschwächten Grippe-Virus-Stämme, zwei geben eine Influenza-Viren und zwei Typ B Influenza-Viren, ausgedrückt in fluoreszierenden Fokus Einheiten oder FFU.
2. Bereiten Sie Impfkulturen in das Glasgefäß eine Kollision 6-Jet Vernebler durch die Schaffung von Suspensionen der gewünschten Konzentrationen von Viruspartikel in 100 mL PBS vor und installieren Sie innerhalb der benutzerdefinierten Bioaerosol-Kammer.
3. Messgeräte zur Messung von Variablen innerhalb der Kammer Bioaerosol, wie Temperatur, % Relative Feuchte, Kohlendioxid-Konzentration und Windgeschwindigkeit (erzeugt mit einem Axialventilator) zu initiieren. Verwenden Sie einen direkten lesenden Aerosol Monitor Massenkonzentration innerhalb der Kammer Bioaerosol verfolgen und Konsistenz innerhalb und zwischen den Prüfungen zu etablieren.
4. Versiegeln der Bioaerosol-Kammer und spülen Sie 10 min mit HEPA-gefilterte Luft.
5. Der Vernebler mit 6,9 kPa liefern Sie gefilterte, getrocknete Luft.
6. Generieren Sie eine Zielkonzentration von viralen Bioaerosole (über Vernebler) in jeder Studie Bioaerosol-Kammer. In dieser Demo werden Bioaerosole mit einer Konzentration von 5 mg/m³ generiert.
7. Die Masse Zielkonzentration des Aerosols angekommen, stoppen Sie Vernebelung.
8. Betreiben Sie eine Luftpumpe Probenahme für jedes flüssige Ausbeute, die zu einer Durchflussmenge von 12,5 L/min Verhalten Kalibrierung mit einem Standard-Primärfluss vor und nach jeder Samplingereignis zur Sicherstellung der Konsistenz in Probenahme Volumen kalibriert wurde. Versorgung Verdünnung der Luft mit einem HEPA-Filtern in der Nähe des Verneblers und konstanten Druck in der Kammer zu erhalten.
9. Genießen Sie aktiv die Bioaerosol Kammeratmosphäre, für einen Zeitraum von 40 min, ein Sampling-Volumen von 500 L pro Probe zu erreichen.
   Hinweis: Sampling für 40 min bei 12,5 L/min mit zwei Pumpen parallel kann für die Probenahme von 1.000 L die Bioaerosol. So wird am Ende des Experiments erwartet, dass die Mehrheit der Luft in der Kammer Bioaerosol entnommen und über ein HEPA Filter System in die Umwelt freigesetzt wurde. Dies wird durch die Abnahme der Partikelkonzentration belegt. Nach dem Experiment werden Oberflächen mit 10 % Haushalt Chlorid und 70 % Ethanol dekontaminiert. Indikatoren sind in dieser Demo verwendet; jedoch kann wenn bekannt, dass pathogene Organismen in diesem System verwendet werden, zusätzliche biologische Maßnahmen bedarf.

(3) Nukleinsäure-Extraktion und qRT-PCR-Nachweis

1. Isolieren Sie Nukleinsäuren direkt vom Anion Austausch Harz und zu Vergleichszwecken, aus der Flüssigkeit innerhalb der flüssigen Impingers verwendet. In diesem Beispiel eine RNA Isolierung ist beschrieben, aber ein ähnliches Protokoll für DNA-Viren genutzt werden.
   1. Nukleinsäure-Isolierung aus dem Anion Austausch Harz.
      1. Übertragen Sie gesamte Anion Austausch Harz-haltige Flüssigkeit von der flüssigen Ausbeute auf eine sterile 50 mL konische Rohr.
      2. Ermöglichen Sie das Harz zu begleichen, und Dekantieren Sie langsam die flüssige Probe aus dem Anion Austausch Harz. Verwenden Sie eine 1 mL-PIPETTENSPITZE, die restliche Flüssigkeit aus dem Anion Austausch Harz entfernen.
      3. Aus einem viralen RNA isolierungskit Hinzufügen von 560 µL virale Lyse Puffer mit Träger RNA direkt an das Anion Austausch Harz und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur mit periodischen mischen.
      4. Mit einer 1 mL-PIPETTENSPITZE übertragen die virale lysate (virale Lyse-Puffer), eine sterile 1,5 mL konische Rohr und fahren Sie mit RNA Isolierung mit einer viralen RNA Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Ausnahme die RNA ist in einem Gesamtvolumen von 60 µL Elution Puffer eluiert.
   2. Nukleinsäure-Isolierung von flüssigen Impingers.
      1. Pipette 140 µL der flüssigen Probe in ein steriles 1,5 mL konische Rohr und RNA-Isolierung mit dem viralen RNA isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Ausnahme der eluierenden RNA in einem Gesamtvolumen von 60 µL Elution Puffer führen.
         Hinweis: 140 µL ist die maximale Sample-Volumen, das mit dem spezifischen viralen RNA isolierungskit hier in einer einstufigen Zubereitung beschäftigt verarbeitet werden können.
2. Führen Sie qRT-PCR zur Detektion von MS2 und Influenza A und B Viren als zuvor beschriebenen^23,24. In dieser Demo werden 5 µL der Nukleinsäure-Eluate für qRT-PCR verwendet.

Ergebnisse

Abbildung 1 veranschaulicht das Prinzip hinter kostenlos-basierte Erfassung von Viren von bioaerosolen durch Einbeziehung des Harzes in flüssig-Impingers. Abbildung 2 zeigt den Aufbau der Custom-Built Bioaerosol Kammer. Abbildung 3 beschreibt die Schritte zur Einrichtung der Aerosolization Experiment und Maßnahmen zur Qualitätssicherung. Abbildung 4 zeigt Verstärkung...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sensible virale Erfassung von bioaerosolen mit modifizierten flüssigen Impingers. Die Methode ist für die Erkennung und Quantifizierung von der Viruslast in bioaerosolen optimiert. Die gezielte Modifizierung demonstriert hier beinhaltet die Zugabe von Flüssigkeit in eine gemeinsame flüssige Impinger enthaltenen Anion Austausch Harz. Diese Methode wurde für seine Einfachheit in nachgeschalteten Probenverarbeitung entwickelt, wobei andere Probe Verarbeitungstechniken wie Z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1)	American Type Culture Collection	ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent	AstraZeneca	Contact manufacturer	Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195
Primers and probes	Integrated DNA Technologies	NA
0.2 µM sterile filter	NA	NA
1 L pyrex bottles or equivalent	NA	NA
1 mL pipet tips	NA	NA
1 mL pipettor	NA	NA
50 mL serological pipet	NA	NA
PCR tubes	NA	NA
Pipet-aid or equivalent	NA	NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit	Qiagen	204443
Amberlite IRA-900 chloride form	Sigma-Aldrich	216585-500G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Water (molecular biology grade)	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher	13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher	14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher	05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX	ThermoFisher	11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set	SKC Inc.	225-9593
Vac-u-Go sample pumps	SKC Inc.	228-9695
Collison nebulizer (6-jet)	BGI Inc.	NA
HEPA capsule	PALL	12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554	TSI Inc.	NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A	TSI Inc.	NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor	TSI Inc.	NA
Bioaerosol chamber	NA	NA