Proceso de moldeo basada en mojado-spinning de gelatina para la regeneración de los tejidos

Resumen

Desarrollamos y describir un protocolo basado en el concepto de hilatura húmeda, para la construcción de la base de gelatina de biomateriales utilizados para la aplicación de la ingeniería de tejidos.

Resumen

Este artículo presenta un método barato para fabricar gelatina, como un polímero natural, en fibras de monofilamento o en otras formas apropiadas. A través de la humedad método de giro, las fibras de la gelatina son producidas por extrusión suave en medio de una coagulación adecuada. Para aumentar la superficie funcional de esas fibras de gelatina y su capacidad para imitar las características de los tejidos, la gelatina puede ser moldeada en forma de tubo haciendo referencia a este concepto. Examinado por pruebas in vitro e in vivo, los tubos de gelatina demuestran un gran potencial para su aplicación en la ingeniería de tejidos. Actuando como un material de relleno adecuado brecha, gelatina de tubos pueden ser utilizados para sustituir el tejido en el área dañada (por ejemplo, en el sistema nervioso o cardiovascular), así como para promover la regeneración al proporcionar una sustitución directa de las células madre y los circuitos neuronales. Este protocolo proporciona un procedimiento detallado para la creación de un biomaterial basado en un polímero natural, y se espera que su aplicación beneficiaría enormemente el desarrollo de polímeros naturales correlativos, que ayudan a realizar estrategias de regeneración de tejido.

Introducción

El último desarrollo en regeneración de tejidos consiste en la aplicación de la ingeniería del tejido fino, que representa un desafío para la mejora de nuevas estrategias terapéuticas en tratamientos médicos. Por ejemplo, el limitado potencial de regeneración del sistema nervioso, lesiones o enfermedad, siguientes plantea un importante problema de salud en todo el mundo. Debido a la complejidad de los procesos patofisiológicos asociados con el sistema nervioso, el uso de autoinjerto tradicional o la aplicación de la cirugía de estabilización ha demostrado ofrecer beneficios en los resultados funcionales, pero no existe evidencia fuerte de los efectos de la fijación espinal cirugía^1,2. El tejido en el área dañada es perdido y sustituido por astrocitos hypertrophically inducido³, eventual formando una densa cicatriz glial^4,5. Esta matriz actúa como una barrera que bloquea la recuperación del nervio funcionan^6,7 y es, así, enormemente obstaculiza la regeneración. Por lo tanto, se espera que un material de relleno adecuado espacio para prevenir la pérdida de tejido y reducir la formación de tejido conectivo asociado a cicatriz manteniendo la integridad de la zona dañada, así como al proporcionar el reemplazo directo de las células neuronales y circuito para promover la regeneración del axón.

Biomateriales poliméricos han preferido como andamios para la terapia de regeneración de tejido, basado en la regulación de la progresión de comportamiento y tejido celular o axón a través del apoyo natural matriz extracelular (ECM). El formato de la fibra se considera comúnmente como un bloque de construcción para los varios materiales, debido a su estructura unidimensional⁸. Las fibras pueden obtenerse generalmente por extrusión de derretimiento o mojado spinning método; sin embargo, el gran tamaño y costo de los equipos y la dificultad para llevar a cabo estos métodos son difíciles. Además, la mayoría de los trabajos relacionados con fibras de polímero se ha centrado en materiales sintéticos o compuestos. Polímeros naturales como fuente de biomateriales ofrecen mejores propiedades de biocompatibilidad para el cuerpo humano. Sin embargo obtener la alineación de las fibras de polímero natural es relativamente más difícil que de polímero sintético fuentes⁹. Por lo tanto, la conversión de un polímero natural como una fuente rica de proteína en las fibras del biomaterial es una estrategia importante, no sólo las fibras del biomaterial se pueden directamente aislada desde la materia prima, evitando una innecesaria transformación en monómeros, pero la fibras de proteína también tienen un buen aspecto y características favorables¹⁰.

En este sentido, se describe un método de tratamiento barato para la fabricación de fibras de polímero natural a través del concepto básico de la hilatura húmeda, que puede ser implementada en la escala de laboratorio para ingeniería de tejidos. Hilado húmedo se realiza en la extrusión y coagulación de una solución de polímero en un nonsolvent de polímero adecuado. Una solución apropiada, viscosa dopada en medio de la coagulación hace que las moléculas del polímero a disolver. A través de la transición de fase, los filamentos entonces pierden su solubilidad y se precipitan en forma de un polímero sólido fase¹¹. Refiriéndose a este concepto, expanden el desarrollo de la gelatina en forma de tubo por un proceso de moldeo, que se considera adecuado para la aplicación de la regeneración de tejido. Además, intrínsecamente, nosotros puede también desarrollar alguna forma de material de fibras de gelatina (por ejemplo, conducto de gelatina enrollada de varias fibras de gelatina), el otro desea aplicaciones.

Gelatina, un polímero natural biodegradable, está formada de colágeno hidrolizado y desnaturalizado, incluyendo cualquier estado helicoidal triple, amorfo o semicristalino de colágeno¹². Es bien sabido que el colágeno es la proteína estructural esencial en todos los tejidos conectivos de los vertebrados e invertebrados^13,14, que es similar a la estructura de las proteínas de la ECM principal que induce el crecimiento del nervio y, al mismo tiempo, reemplaza una gran cantidad de glycosaminoglycan secretada durante las lesiones de la médula espinal. Por lo tanto, el uso de gelatina como una fuente sería una gran opción para cualquier vehículo médico. Además de ser una fuente barata, la gelatina también es biodegradable y cytocompatible y clínicamente probados ser un temporal defecto relleno¹⁵. Desarrollado en forma de tubo, descritas aquí las pruebas in vitro e in vivo demuestran que la gelatina tiene una excelente biocompatibilidad y conveniencia para futuros usos de la ingeniería del tejido. Cultivados con células madre adiposas humanas, tubos de gelatina mejoran diferenciación celular en las células progenitoras neurales utilizando tinción nestina positivas como un marcador de células neuronales. Además, gelatina como material de terraplenado gap, como producidos por el método establecido en el presente estudio, se espera que sea manejable y segura y de gran beneficio para ingenieros de tejido que actualmente están desarrollando polímeros naturales correlativos para el fortalecimiento del tejido estrategias de regeneración.

Protocolo

Los tejidos de grasa obtenidos de cirugías ortopédicas como certificada por el institucional de Junta de Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. procedimientos con sujetos animales han sido aprobados por el Comité de cuidado del Animal a nivel nacional Centro médico de la defensa, Taiwán (ROC).

1. Moje el proceso de giro

1. Preparación de la solución
   1. Disolver 5 g de polvo de gelatina en 100 mL de agua destilada doble para obtener la concentración de la solución 5% (p/v).
   2. Revolver la mezcla lentamente en el 60-70 ° C durante la noche para lograr una dispersión totalmente homogénea sin burbujas.
2. Mojado de spinning
   1. Formación de la fibra
      Nota: En la figura 1Ase muestra un esquema del método. La configuración de giro está equipada con una máquina de bomba peristáltica (véase Tabla de materiales) que proporciona alta precisión velocidad y controla la entrega suave de la corriente.
      1. Conecte una jeringa de 26 x 1/2 pulgada (0,45 x 12 mm) como el inyector de solución tubo de vinilo transparente.
      2. Preparar 100 mL de solución de acetona 99,5% en un vaso de vaso de precipitados para utilizarse como el baño de coagulación.
      3. Funcionar la máquina de la bomba peristáltica a 21 rpm (3,25 mL/min) y déjelo durante varios segundos en solución de acetona antes de rodar para arriba la solución de gelatina.
      4. Sacar las fibras de la gelatina de la solución de acetona y sumergirlos en 2,5% (p/v) de solución de policaprolactona/diclorometano (PCL/DCM) con 1:20 (w/w).
      5. Dejar que la gelatina de fibras en la solución PCL/DCM seco durante la noche, debajo de la campana a temperatura ambiente.
   2. Formación de tubo
      Nota: Un esquema del método se muestra en la figura 1B.
      1. Utilizar un catéter venoso periférico de 24 x 3/4 de pulgada (0,7 x 19 mm) como molde de tubo.
      2. Cargar el catéter en la solución de gelatina y mantenerlo allí durante 3 s.
      3. Cargue el catéter en la solución de acetona y sostenga por 1 minuto.
      4. Cargar otra vez el catéter en la solución de gelatina y mantenerlo allí durante 3 s.
      5. Repita este procedimiento alternativo 20 x.
      6. Sacar el catéter de la solución de acetona y dejar que el tubo moldeado a secar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      7. Sacar suavemente el tubo de gelatina del catéter utilizando una pinza hemostática y transferir cuidadosamente el tubo de gelatina en un vaso de pipeta Pasteur con la inmersión de 2,5% (p/v) de la solución PCL/DCM.
      8. Que la pipeta de Pasteur que contiene que el tubo de gelatina y PCL/DCM solución seca durante la noche, debajo de la campana a temperatura ambiente.

2. morfología del tubo de gelatina

1. Monte la pieza de tubo de gelatina seca en un trozo de carbón.
2. Poner la muestra en la máquina de ion sputter coater (véase Tabla de materiales) y la capa de la muestra de oro de 60 s; Luego, observar su morfología por microscopía electrónica de barrido (véase Tabla de materiales).

3. cultivo de células madre adiposas humanas

1. Coloque el tejido graso (obtenida de tejido adiposo oral por cirugía clínica) en una placa Petri que contiene 10 mL de solución de transferencia consisten en 0.1 M tampón fosfato salino (PBS) 1% de penicilina/estreptomicina y 0.1% de glucosa.
2. Cortar los tejidos en trozos pequeños (menos de 1 mm²) con una hoja de bisturí.
3. Transferencia de los tejidos en un tubo de plástico de 15 mL y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos.
4. Quite el sobrenadante e incubar el sedimento en un tubo de plástico que contiene 10 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, que consta de 4 mM L-glutamina, 1 mM sodio piruvato y rojo de fenol de 15 mg/L) con colagenasa de 0.1% a 37 ° C, en un ambiente humidificado que contiene 95% aire y 5% CO₂, para 1 día.
5. Centrifugar el tubo de plástico a 500 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante cuidadosamente (no tocar el sedimento), a continuación, suspender el sedimento suavemente agregando 10 mL de DMEM con 10% suero bovino fetal (FBS) y dejar reposar durante 1 día a 37 ° C , en un ambiente humidificado que contenga 95% aire y 5% CO₂.
6. Centrifugar el tubo de plástico a 500 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante con cuidado; Luego, añada 1 mL de medio de células madre (formado por queratinocitos medio sin suero (K-SFM), 5% de FBS, N-acetyl-L-cisteína, ácido ascórbico 2-fosfato, estreptomicina y anfotericina) a suspender el sedimento, transferirlo a un matraz de cultivo T25 que contiene 4 mL de medio de celular y dejar reposar durante 3 días a 37 ° C, en un ambiente humidificado que contenga 95% aire y 5% CO₂.
7. Descartar el sobrenadante, agregar 1 mL de ácido de 0.25% tripsina-etilendiaminotetracético (EDTA) e incubar a 37 ° C, en un ambiente humidificado que contiene 95% aire y 5% CO₂ para 3,5 min, para separar las células de la parte inferior del frasco de cultivo.
8. Añadir 1 mL de SBF, suspender la mezcla y transferir a un tubo de microcentrífuga.
9. Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 3,5 minutos, suspender el sedimento con 1 mL de medio de la célula de vástago y transferir al matraz de cultivo que contiene 5 mL de medio de la célula de vástago; Luego, mantenerla a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenga 95% aire y 5% CO₂.
10. Mantener la subcultura cambiando el medio de la célula de vástago cada 3 días.

4. cultivo de células en el tubo de gelatina

1. Esterilizar el tubo de gelatina con la luz UV por 2 h; a continuación, sumergirlo en etanol 75% (v/v) y lavarlo 2 x medio de células madre para eliminar el etanol residual.
2. Recoger las células adiposas humanas (hASCs) del frasco de cultivo.
   1. Retire el medio del frasco de cultivo.
   2. Añadir 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenga 95% aire y 5% CO₂ 3,5 min, para separar el hASCs de la parte inferior del frasco de cultivo.
   3. Añadir 1 mL de SBF, suspender la mezcla y transferir a un tubo de microcentrífuga.
   4. Centrifugar el tubo de microcentrífuga a 500 x g durante 3,5 min.; a continuación, descartar el sobrenadante cuidadosamente y suspender el sedimento con 1 mL de medio de células madre.
3. Coloque el tubo de gelatina en una placa de 6 pozos que contiene 3 mL de medio de la célula de vástago y semilla de 4 x 10⁴ de hASCs en el tubo; Incúbelos durante 2 semanas a 37 ° C, en un ambiente humidificado que contenga 95% aire y 5% CO₂.
4. Cambiar el medio de la célula de vástago cada 3 días para proporcionar la suficiente nutrición para el crecimiento de la célula.

5. inmunocitoquímica

1. Retire el medio de la célula de vástago y lavar el pozo con PBS.
2. Fijar el tubo con células con 0,1% de ácido acético glacial durante 30 min a temperatura ambiente.
3. El bien 2 x de lavado con PBS.
4. Añadir un surfactante (NP-40, 0.05%) e incubar 10 min a temperatura ambiente.
5. Lave bien 3 veces con PBS.
6. Agregar 2% de suero normal de cabra e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
7. Decantar la solución, añadir anticuerpo primario nestina (marcador de células progenitoras neurales) e incubar durante una noche a 4 ° C.
8. Lave bien 3 veces con PBS.
9. Añadir el anticuerpo secundario burro anti-ratón anti-fluoresceína isotiocianato (FITC) y mantener la muestra en la oscuridad durante 2 h.
10. Lave bien 3 veces con PBS.
11. Añadir 1 mL de Hoechst 33342 a teñir los núcleos e incubar 10 min a temperatura ambiente.
12. Lavar el pozo suavemente y observar bajo un microscopio de fluorescencia.

6. en la prueba de Biocompatibility de Vivo

Nota: Ratas con un peso entre 201-225 g han probado con éxito usando este protocolo.

1. Anestesia
   1. Inducir y mantener la anestesia; preferiblemente, anestesiar una rata (rata de Sprague Dawley de 8 semanas de edad, mujer) por medio de una inyección intramuscular de tiletamina y zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg, respectivamente) y xilacina (5 mg/kg). Realizar una prueba de estimulación de dolor presionando los dedos de la rata para confirmar la anestesia.
2. Esterilización del campo quirúrgico
   1. Afeite y limpie la piel del área del trapecio de rata (en la parte posterior del cuello) y limpiar con la loción de povidona-yodo para preparar la condición aséptica de la piel (100 mg/mL).
   2. Cubrir la rata con cortinas quirúrgicos estériles para reducir la transferencia bacteriana y la subsecuente contaminación del sitio quirúrgico.
3. Implantación de la tubo de gelatina
   1. Corte suavemente la piel del área del trapecio de rata con una tijera quirúrgica.
   2. Crear una herida de 2 cm y coloque el tubo de gelatina directamente en la capa entre la fascia y el músculo.
4. Cirugía de postimplantación
   1. Cerrar la herida con sutura de nylon y limpie con solución de povidona-yodo (100 mg/mL).
   2. Inducir a la rata a través de una inyección intramuscular de ketoprofeno (2,5 mg/kg) y cefazolina (15 mg/kg).
   3. Mantener la rata bajo condiciones asépticas durante 7 días.
5. Eutanasia
   1. Rata es sacrificada por asfixia de CO₂ según pautas de AVMA para eutanasia. Confirman la muerte de la rata por el pellizco del dedo del pie y la cola, siguió tocando pecho para garantizar los latidos del corazón.
   2. Corte la rata suavemente con una hoja de bisturí, quitar el tejido implantado y tomar fotos para su observación.

Resultados

En este estudio, desarrollamos con éxito la gelatina en las fibras (figura 2A) y tubos (figura 2B, C) a través del concepto de hilado húmedo fácil de usar. Estos materiales a base de gelatina pueden ser utilizados como cualquier herramienta médica, dependiendo de sus formas. Teniendo en cuenta que la superficie funcional y el marco de tales materiales son más adecuados para la regeneración...

Discusión

Presentamos el desarrollo de biomateriales basados en gelatina usando un simple mojado spinning técnica que puede ser aplicado en el estudio de polímeros naturales para regeneración de tejidos. Este trabajo demostró la posibilidad de fabricación de la gelatina como una fuente de proteína grandes sin la adición de otras fuentes, con el objetivo de optimizar las propiedades de la gelatina sí mismo. El desarrollo de biomateriales basados en gelatina se realizó enteramente en temperatura ambiente (22-26 ° C). Prepa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-