Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration

Zusammenfassung

Wir entwickelten und beschreiben ein Protokoll basiert auf dem nass Spinnerei-Konzept für den Bau von Gelatine-basierten Biomaterialien für die Anwendung des Tissue Engineering verwendet.

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine kostengünstige Methode, um Gelatine, als ein natürliches Polymer in monofilen Fasern oder andere geeignetsten Formen zu fabrizieren. Durch den nassen Methode Spinnen werden Gelatine-Fasern durch reibungslosen Extrusion in einem geeigneten Koagulation Medium produziert. Zur Erhöhung der funktionalen Oberfläche diese Gelatine-Fasern und ihre Fähigkeit, die Eigenschaften der Gewebe nachahmen kann Gelatine in eine u-Form geformt werden, mit dem Hinweis auf dieses Konzept. Von in-vitro- und in-vivo-Tests untersucht, zeigen die Gelatine-Röhren ein großes Potenzial für den Einsatz in Gewebetechnik. Handeln als geeignete Lücke Füllmaterial, Gelatine, die Rohre, das Gewebe in den beschädigten Bereich (z. B. in der nervös oder Herz-Kreislauf-System) zu ersetzen, sowie die Regeneration zu fördern, durch die Bereitstellung eines direkten Ersatz von Stammzellen und neuralen Schaltkreis verwendet werden können. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Erstellen von Biomaterial basierend auf ein natürliches Polymer, und seine Umsetzung wird voraussichtlich die Entwicklung von korrelativen natürlichen Polymeren, profitieren die Gewebe Regenerationsstrategien realisieren helfen.

Einleitung

Die neueste Entwicklung in der Geweberegeneration beinhaltet die Anwendung des Tissue Engineering, was eine Herausforderung für die Verbesserung der neue Therapiestrategien bei medizinischen Behandlungen darstellt. Zum Beispiel stellt das begrenzte Potential des Nervensystems Regenerierung, folgende Verletzungen oder Krankheiten, ein erhebliche gesundheitliche Problem weltweit. Aufgrund der Komplexität der pathophysiologischen Prozesse im Zusammenhang mit dem Nervensystem die Verwendung von traditionellen Spendertransplantat oder die Umsetzung der Stabilisierung Chirurgie hat gezeigt, dass Vorteile in funktionellen Ergebnisse bieten, aber es gibt keine Evidenz für die Auswirkungen von spinaler Fixierung Chirurgie^1,2. Das Gewebe an den beschädigten Bereich verloren und ersetzt mit hypertrophisch induzierte Astrozyten³, schließlich bildet einen dichten glial Narbe^4,5. Diese Matrix dient als eine Sperre, dass Blöcke die Erholung des Nervs Funktion^6,7 und ist somit erheblich behindert Regeneration. Daher geeignete Füllmaterial Lücke wird voraussichtlich verhindern den Verlust von Gewebe und reduzieren die Bildung von Bindegewebe Narbe verbunden, durch die Aufrechterhaltung der Integrität der beschädigten Bereich sowie durch Bereitstellung den direkten Ersatz von neuronalen Zellen und Schaltung, Axon Regeneration zu fördern.

Polymere Biomaterialien wurden als Gerüste für Gewebe-Regeneration-Therapie, basierend auf der Verordnung der Zelle oder Axon Verhalten und Gewebe Progression durch natürliche extrazelluläre Matrix (ECM) Unterstützung bevorzugt. Das Faser-Format gilt allgemein als ein Baustein für verschiedene Materialien, aufgrund deren eindimensionale Struktur⁸. Die Fasern erhalten Sie in der Regel durch Schmelze Extrusion oder nass Spinnerei Methode; Allerdings sind die Größe und die Kosten für die Ausrüstung und die Schwierigkeit, diese Methoden ausführen herausfordernd. Darüber hinaus hat ein Großteil der Arbeit im Zusammenhang mit Polymerfasern auf synthetische oder zusammengesetzte Materialien konzentriert. Natürliche Polymere als Quelle von Biomaterial bieten bessere Biokompatibilität Eigenschaften für den menschlichen Körper. Um die Ausrichtung des natürlichen Polymerfasern zu erhalten ist jedoch relativ schwieriger als synthetische Polymer Quellen⁹. Daher ist die Umwandlung von ein natürliches Polymer als eine reiche Quelle von Protein in Biomaterial Fasern eine wichtige Strategie — nicht nur können der Biomaterial-Fasern werden direkt isoliert vom Rohstoff, wodurch eine unnötige Transformation zu Monomeren, aber die Protein-Fasern haben auch ein gutes Aussehen und positive Eigenschaften¹⁰.

In diesem Zusammenhang beschreiben wir eine kostengünstige Verarbeitungsmethode für die Herstellung von natürlichen Polymerfasern durch das Grundkonzept der nass Spinnerei, die im Labormaßstab für das Tissue Engineering umgesetzt werden können. Nass Spinnerei erfolgt durch die Extrusion und Koagulation von einer Polymerlösung in einem geeigneten Polymers Nonsolvent. Eine geeignete, zähflüssige Lösung dotierten in Koagulation Medium bewirkt, dass die Polymermoleküle aufzulösen. Durch den Phasenübergang die Filamente dann verlieren ihre Löslichkeit und in Form von einem festen Polymers Phase¹¹ausgefällt werden. Unter Bezugnahme auf dieses Konzept, erweiterten wir dann die Entwicklung der Gelatine in die u-Form um einen Spritzgießprozess, das richtige für Gewebe-Regeneration-Anwendung gilt. Intrinsisch, darüber hinaus entwickeln wir auch jede Form von Material aus Gelatine Fasern (z. B. Gelatine Conduit aufgerollt aus mehreren Fasern, Gelatine), für andere Anwendungen gewünscht.

Gelatine, ein biologisch abbaubares natürliches Polymer aus denaturierten und hydrolysiertes Kollagen, einschließlich eines teilkristallinen, amorphen oder Dreibettzimmer spiralförmigen Bundesstaates Kollagen¹²gebildet wird. Es ist bekannt, dass Kollagen ist die wesentlichen Strukturprotein in alle Bindegewebe der Wirbeltiere und Wirbellose^13,14, die ähnlich wie die Proteinstruktur des wichtigsten ECM ist das Nervenwachstum induziert und, gleichzeitig ersetzt eine große Menge an Glykosaminoglykan abgesondert während Verletzungen des Rückenmarks. Daher wäre die Verwendung von Gelatine als Quelle eine gute Wahl für alle Fahrzeuge, medizinische. Abgesehen davon, dass eine günstige Quelle, Gelatine ist auch biologisch abbaubar und Cytocompatible und klinisch geprüft zu werden, eine vorübergehende defekt Füller¹⁵. Entwickelte sich zu einer Röhre Form, zeigen hier beschriebenen in-vitro- und in-vivo-Tests, dass Gelatine hat eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Eignung für zukünftige Tissue engineering-Anwendungen. Kultivierten mit menschlichen Fettgewebe Stammzellen verbessern Gelatine Röhren Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen mit positiven nestin Färbung als neuronale Zelle Marker. Darüber hinaus dürfte Gelatine als Füllmaterial Lücke, wie durch die in dieser Studie etablierte Methode produziert, überschaubar und sicher sein und Gewebe Ingenieure profitieren, die derzeit korrelative natürliche Polymeren zur Verbesserung der Gewebe entwickeln Regenerationsstrategien.

Protokoll

Das Fettgewebe stammen aus orthopädischen Operationen, wie von der institutionellen Review Board der Tri-Service General Hospital zertifiziert, Taipei, Taiwan, r.o.c. Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen von Animal Care Committee auf nationaler genehmigt worden Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C).

1. nass Spinnerei Prozess

1. Vorbereitung der Lösung
   1. Lösen Sie 5 g Gelatine-Pulver in 100 mL bidestilliertem Wasser, Konzentration von 5 % (w/V) Lösung zu erhalten.
   2. Rühren Sie die Mischung langsam bei 60-70 ° C über Nacht eine völlig homogene Dispersion blasenfrei zu erreichen.
2. Nass Spinnerei
   1. Faser-Bildung
      Hinweis: Abbildung 1Azeigt eine schematische Darstellung der Methode. Das Spinnen-Setup ist ausgestattet mit einer peristaltischen Pumpe Maschine (siehe Tabelle der Materialien), die bietet Hochpräzisions Geschwindigkeit und steuert die reibungslose Lieferung des Stroms.
      1. Klares Vinyl Schlauch stecken Sie 26 X 1/2 Zoll (0,45 x 12 mm) Spritze als Lösung Injektor.
      2. Bereiten Sie 100 mL 99,5 % Aceton-Lösung in ein Becherglas Glas als Koagulation Bad verwendet werden.
      3. Laufen Sie die peristaltischen Pumpe Maschine, bei 21 u/min (3,25 mL/min) und lassen Sie die Gelatinelösung stehen für mehrere Sekunden in Aceton-Lösung vor dem einrollen.
      4. Nehmen Sie die Gelatine-Fasern aus der Aceton-Lösung und Tauchen sie in 2,5 % (w/V) Polycaprolactons/Dichlormethan (PCL/DCM) Lösung mit 01:20 (w/w).
      5. Lassen Sie die Gelatine, die Fasern in der PCL/DCM Lösung trocken unter der Haube bei Raumtemperatur über Nacht.
   2. Rohr-Bildung
      Hinweis: Abbildung 1Bzeigt eine schematische Darstellung der Methode.
      1. Verwenden Sie einen peripheren Venenkatheter 24 X 3/4 Zoll (0,7 x 19 mm) als Rohr Schimmel.
      2. Laden Sie den Katheter in die Gelatine-Lösung und halten Sie ihn dort für 3 s.
      3. Laden Sie den Katheter in die Aceton-Lösung und 1 min warten.
      4. Laden Sie den Katheter wieder in die Gelatine-Lösung und halten Sie ihn dort für 3 s.
      5. Wiederholen Sie dieses alternative Verfahren 20 X.
      6. Nehmen Sie den Katheter aus der Aceton-Lösung und lassen Sie das geformte Rohr bei 5 min bei Raumtemperatur trocknen.
      7. Herausnehmen Sie sanft die Gelatine-Röhre aus der Katheter mit einer Gefäßklemme und übertragen Sie sorgfältig die Gelatine-Schlauch in ein Glas Pasteurpipette mit das Eintauchen von 2,5 % (w/V) PCL/DCM-Lösung.
      8. Lassen Sie die Pasteur Pipette enthält, die die Gelatine Rohr- und PCL/DCM-Lösung trocken unter der Haube bei Raumtemperatur Übernachtung.

2. Morphologie der Gelatine-Röhre

1. Montieren Sie das Stück getrocknete Gelatine Schlauch an eine Kohlenstoff-Stub.
2. Legen Sie die Probe in die Ionen-Sputter Coater Maschine (siehe Tabelle der Materialien) und Mantel die Probe mit Gold für 60 s; dann beobachten seiner Morphologie von Rasterelektronenmikroskopie (siehe Tabelle der Materialien).

3. Kultur von menschlichen Fettgewebe Stammzellen

1. Platzieren Sie das Fettgewebe (gewonnen aus mündlichen Fettgewebe durch klinische Chirurgie) in eine Petrischale mit 10 mL Transferlösung bestehend aus 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,1 % Glukose.
2. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke (weniger als 1 mm²) mit einer Skalpellklinge.
3. Übertragen Sie das Gewebe in eine 15 mL Kunststoffrohr und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min.
4. Den Überstand zu entfernen und das Sediment in ein Kunststoffrohr mit 10 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM, bestehend aus 4 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 15 mg/L Phenol rot) mit 0,1 % Kollagenase bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre inkubieren 95 % Luft und 5 % CO₂, enthält für 1 Tag.
5. Das Kunststoffrohr 500 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand sorgfältig entsorgen (das Sediment nicht berühren), und dann das Sediment sanft durch Zugabe von 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) auszusetzen und 1 Tag bei 37 ° C stehen lassen , in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO₂.
6. Das Kunststoffrohr 500 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand vorsichtig zu verwerfen; Fügen Sie 1 mL der Stammzell-Medium (bestehend aus Keratinozyten serumfreien Medium (K-SFM), 5 % der FBS, N-Acetyl-L-Cystein, Ascorbinsäure-2-Phosphat, Streptomycin und Amphotericin) auszusetzen, das Sediment, übertragen Sie sie in ein T25-Kultur-Fläschchen mit 4 mL Zelle Medium stammen, und 3 Tage bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO₂stehen lassen.
7. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und inkubieren Sie es bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO₂ für 3,5 min, um die Zellen von der Unterseite des Kolbens Kultur zu lösen.
8. Fügen Sie 1 mL der FBS, auszusetzen Sie, die Mischung und auf einem Microcentrifuge Schlauch übertragen.
9. Zentrifugieren Sie die Federung bei 500 X g für 3,5 min, auszusetzen Sie das Sediment mit 1 mL der Stammzell-Medium und in der Kultur-Flasche mit 5 mL Medium Stammzellen übertragen; dann halten Sie es bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO₂.
10. Pflegen Sie die Subkultur durch Ändern der Stammzell-Medium alle 3 Tage.

(4) die Kultivierung von Zellen mit der Gelatine-U-Bahn

1. Sterilisieren Sie die Gelatine-Röhre mit UV-Licht für 2 h; dann tauchen sie in 75 % (V/V) Ethanol und waschen Sie es 2 X mit Stammzell-Medium, das restliche Ethanol zu entfernen.
2. Sammeln Sie die menschlichen Fettgewebe Stammzellen (hASCs) aus der Kultur-Flasche.
   1. Entfernen Sie das Medium aus der Kultur-Flasche.
   2. Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO₂ 3,5 min, hASCs von der Unterseite des Kolbens Kultur zu lösen.
   3. Fügen Sie 1 mL der FBS, auszusetzen Sie, die Mischung und auf einem Microcentrifuge Schlauch übertragen.
   4. Zentrifugieren Sie die Microcentrifuge Schlauch 500 X g für 3,5 min; dann verwerfen des Überstands vorsichtig, und unterbrechen das Sediment mit 1 mL der Stammzell-Medium.
3. Legen Sie die Gelatine-Röhre in eine 6-Well-Platte mit 3 mL Stammzell-Medium und Samen Sie 4 x 10⁴ der hASCs am Rohr; inkubieren sie für 2 Wochen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO₂.
4. Ändern der Stammzell-Medium alle 3 Tage um genug Nahrung für das Zellwachstum zu bieten.

(5) Immunocytochemistry

1. Die Stammzell-Medium zu entfernen und den Brunnen mit PBS waschen.
2. Befestigen Sie den Schlauch mit Zellen mit 0,1 % Essigsäure glacial für 30 min bei Raumtemperatur.
3. Die gut 2 X waschen mit PBS.
4. Fügen Sie ein Tensid (NP-40, 0,05 %) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.
6. Fügen Sie 2 % normalem Ziegenserum und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
7. Dekantieren Sie die Lösung zu, fügen Sie Primärantikörper nestin (neurale Vorläuferzellen Zellmarkierung hinzu) und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
8. Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.
9. Fügen Sie Sekundärantikörper Esel anti-mouse-Fluorescein erfolgt (FITC) und halten Sie die Probe in der Dunkelheit für 2 h.
10. Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.
11. Fügen Sie 1 mL der Hoechst 33342 zu färben die Kerne und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
12. Waschen Sie den Brunnen sanft und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.

(6) in Vivo Biokompatibilität Test

Hinweis: Ratten mit einem Gewicht zwischen 201-225 g wurden unter Verwendung dieses Protokolls erfolgreich getestet.

1. Anästhesie
   1. Induzieren und Anästhesie zu erhalten; vorzugsweise ein Ratte (8 Wochen alten Sprague-Dawley Ratten, weiblich) durch eine intramuskuläre Injektion von Tiletamin und Zolazepam zu betäuben (25 mg / kg + 25 mg / kg, beziehungsweise) und Xylazin (5 mg/kg). Führen Sie einen Schmerz Stimulation Test durch Drücken der Ratte in den Fingern, die Anesthetization zu bestätigen.
2. Sterilisation von der Operationsstelle
   1. Rasieren Sie und reinigen Sie die Haut der Ratte in den Trapezius Bereich (über der Rückseite des Halses) und wischen Sie es mit Povidon-Jod-Lotion zur Vorbereitung des aseptischen Zustand der Haut (100 mg/mL).
   2. Decken Sie die Ratte mit sterilen OP-Tüchern, bakterielle Übertragung und nachträgliche Kontamination an der Operationsstelle zu reduzieren.
3. Implantation von Gelatine-Rohr
   1. Schneiden Sie vorsichtig die Haut der Ratte in den Trapezius Bereich mit einer chirurgischen Schere.
   2. Erstellen Sie eine Wunde von 2 cm und legen Sie die Gelatine-Röhre direkt auf die Schicht zwischen der Faszie und der Muskel.
4. Postimplantation Chirurgie
   1. Schließen Sie die Wunde mit Nylon-Naht und wischen Sie es mit Povidon-Jod-Lösung (100 mg/mL).
   2. Induzieren Sie die Ratte über eine intramuskuläre Injektion von Ketoprofen (2,5 mg/kg) und Cefazolin (15 mg/kg).
   3. Halten Sie die Ratte unter aseptischen Bedingungen für 7 Tage.
5. Euthanasie
   1. Ratte ist über CO₂ Erstickung nach AVMA Richtlinien für Euthanasie eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod der Ratte durch Zehe und Tail Prise, gefolgt von Brust zu berühren, um den Herzschlag zu gewährleisten.
   2. Schneiden Sie die Ratte sanft mit einer Skalpellklinge, entfernen des implantierten Gewebes und fotografieren für die Beobachtung.

Ergebnisse

In dieser Studie haben wir erfolgreich die Gelatine in Fasern (Abb. 2A) und Rohre (Abbildung 2B, C) durch das benutzerfreundliche nass Spinnerei-Konzept entwickelt. Diese Gelatine-basierte Materialien können als jede medizinische Instrument, je nach ihrer Form genutzt werden. Wenn man bedenkt, dass die funktionale Oberfläche und Rahmen solcher Materialien besser geeignet für die Geweberegenera...

Diskussion

Wir präsentiert die Entwicklung von Gelatine-basierten Biomaterialien mit einem einfachen nassen Drehtechnik, die in der Studie von natürlichen Polymeren für die Geweberegeneration angewendet werden können. Diese Arbeit zeigte die Möglichkeit der Herstellung von Gelatine als eine gute Proteinquelle ohne Zusatz von anderen Quellen, mit dem Ziel, die Eigenschaften der Gelatine selbst optimieren. Die Entwicklung der Gelatine-basierten Biomaterialien wurde vollständig in Raumtemperatur (22-26 ° C) durchgeführt. Eine ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-