Процесс литья на основе мокрого прядения желатина для регенерации тканей

Резюме

Мы разработали и описать протокол, основанный на концепции мокрого прядения, для строительства на основе желатина биоматериалов, используемых для применения тканевой инженерии.

Аннотация

Эта статья представляет недорогой метод для изготовления желатин, как природный полимер, леска волокон или другие надлежащие формы. Через мокрый, спиннинг метод желатин волокон производятся гладкой экструзии в среде подходящей коагуляции. Чтобы увеличить функциональные поверхности этих волокон желатина и их способность имитировать функции тканей, желатин можно формовать в форму трубки, ссылаясь на этой концепции. Рассмотренные в vitro и in vivo тесты, желатин трубы демонстрируют большой потенциал для применения в тканевой инженерии. Действуя в качестве подходящего разрыв наполнителя, желатин, трубы могут быть использованы для замены тканей в поврежденной области (например, в нервной и сердечно-сосудистой системы), а также способствовать регенерации путем предоставления прямой замены стволовых клеток и нейронных сетей. Этот протокол предоставляет подробные процедуры для создания биоматериала, на основе природного полимера, и его осуществление, как ожидается, значительно способствовали развитию коррелятивных природных полимеров, которые помогают реализовать стратегии регенерации тканей.

Введение

Последняя разработка в регенерации тканей предполагает применение тканевой инженерии, которая представляет собой вызов для совершенствования новых терапевтических стратегий медицинского лечения. Например ограниченный потенциал регенерации нервной системы, следующие травмы или болезни, создает проблему значительного здравоохранения во всем мире. Из-за сложности патофизиологических процессов, связанных с нервной системой использование традиционных аутотрансплантатом или осуществление стабилизации хирургии было показано, чтобы предложить преимущества в функциональных результатов, но нет сильных доказательств для эффекты позвоночника Фиксация хирургии^1,2. Ткани на поврежденную область потеряла и заменен на hypertrophically индуцированных астроциты³, сформировав плотной глиальный рубец^4,5. Эта матрица действует как барьер, что блоки нерва функционируют^6,7 и, таким образом, значительно препятствует регенерации. Таким образом, подходящие пломбировочный материал разрыв ожидается предотвратить потерю ткани и уменьшить образование связанных рубцовой соединительной ткани, поддержание целостности поврежденной области, а также путем предоставления прямой замены нервных клеток и Схема регенерации аксона.

Полимерные биоматериалы были предпочтительным, как строительные леса для терапии регенерации тканей, основанные на регулировании ячейки или аксона тканей и поведение прогрессии через поддержку естественных внеклеточного матрикса (ECM). Формат волокна обычно рассматривается как строительный блок для различных материалов, благодаря его одномерные структуры⁸. Волокна могут быть получены как правило экструзия расплава или влажная, спиннинг метод; Однако большого размера и стоимости оборудования и сложности для выполнения этих методов являются сложным. Кроме того большинство работы, связанной с полимерного волокна была сосредоточена на синтетические или композитных материалов. Полимеры природные в качестве источника биоматериала предлагают лучше биосовместимость свойствами для организма человека. Тем не менее для получения выравнивание естественных полимерных волокон является относительно более сложным, чем синтетические полимерные источники⁹. Таким образом, преобразование естественных полимеров как богатый источник белка в биоматериала волокна является важной стратегией — не только биоматериала волокна можно непосредственно изолированы от сырья, таким образом избегая ненужного преобразования до мономеров, но белковых волокон также имеют хороший внешний вид и благоприятные характеристики¹⁰.

В этой связи мы описываем метод недорогой обработки для изготовления волокон природного полимера через основные концепции мокрого прядения, которые могут быть реализованы на лабораторных установках для тканевой инженерии. Мокрого прядения выполняется путем экструзии и коагуляции раствора полимера в подходящей полимер нерастворитель. Необходимости, вязкой допированном в среду коагуляции приводит молекулы полимера распустить. Через фазового перехода нити затем потерять их растворимости и осаждаются в виде твердого полимера этапа¹¹. Ссылаясь на этой концепции, мы затем расширил развития желатин в форму трубки процессом литья, который считается надлежащего применения регенерации тканей. Кроме того, неразрывно, мы также можем разработать любой формы, материала из желатина волокон (например, желатин каналом закатал из нескольких волокон желатина), для других желаемых приложений.

Желатин, биоразлагаемые природный полимер, формируется из денатурированные и гидролизованный коллаген, включая любые semicrystalline, аморфный или тройной винтовой состояние коллагена¹². Хорошо известно, что коллаген является основным структурного белка во всех соединительных тканях позвоночных и беспозвоночных^13,14, которая похожа на структуру белка главный ЭВМ, которая вызывает рост нервных и, одновременно заменяет большое количество Гликозаминогликан, выделяется во время травм спинного мозга. Таким образом использование желатина в качестве источника будет отличным выбором для любого медицинского автомобиля. Помимо того, что недорогой источник, желатин также биоразлагаемых и cytocompatible и клинически доказано, чтобы быть временный дефект наполнитель¹⁵. Превратился в форму трубки, в vitro и in vivo тесты, описанные здесь продемонстрировать, что желатин есть отличная биосовместимость и пригодность для будущих ткани инженерных приложений. Культивировали с жировых стволовых клеток человека, желатин трубы улучшить клеточная дифференцировка в нейронных прогениторных клеток, используя позитивные Нестин окрашивание как маркер нервных клеток. Кроме того желатин, как заполнение разрыва материала, как метода, в этом исследовании, ожидается быть управляемой и безопасной и пользу ткани инженеров, которые в настоящее время разрабатывают коррелятивных природных полимеров для укрепления тканей Регенерация стратегии.

протокол

Жировой ткани были получены от ортопедических операций, как заверенные институционального обзора Совет из Tri-служба больницы общего профиля, Тайбэй, Тайвань, R.O.C. процедуры с участием животных субъектов были утверждены Комитетом по уход животных на национальном Медицинский центр обороны, Тайвань (R.O.C).

1. Смочите спиннинг процесс

1. Подготовка решения
   1. Растворяют 5 г порошка желатина в 100 мл двойной дистиллированной воды для получения 5% (w/v) концентрации раствора.
   2. Перемешайте смесь медленно в 60-70 ° C на ночь для достижения полностью однородной дисперсии без каких-либо пузыри.
2. Мокрого прядения
   1. Образование волокна
      Примечание: Схема метода показан на рисунке 1A. Спиннинг установки оснащен Перистальтический насос машины (см. Таблицу материалы), обеспечивает высокоточный скорость и управляет гладкой доставки потока.
      1. Подключите 26 G x 1/2 дюйма (0,45 мм x 12 мм) шприц как решение инжектор ясно виниловые трубки.
      2. Подготовка 100 мл раствора ацетона 99,5% в стакан стекло, чтобы использоваться как ванна коагуляции.
      3. Запустить машину Перистальтический насос на 21 об/мин (3.25 мл/мин) и пусть раствор желатина постоять несколько секунд в раствор ацетона перед прокаткой его.
      4. Возьмите желатин волокон из ацетона раствор и погрузить их в 2,5% (w/v) поликапролактон/Дихлорметан (PCL/DCM) раствора с 1:20 (w/w).
      5. Пусть желатина, волокна в PCL/DCM раствор сухой ночлег, под капотом при комнатной температуре.
   2. Трубку
      Примечание: Схема метода показан на рисунке 1B.
      1. Использования периферического венозного катетера 24 G x 3/4 дюйма (0.7 мм x 19 мм) как пробки плесени.
      2. Загрузить катетер в раствор желатина и держать его там для 3 s.
      3. Загрузить катетер в раствор ацетона и удерживайте в течение 1 мин.
      4. Снова загрузить катетер в раствор желатина и держать его там для 3 s.
      5. Повторите это альтернативные процедуры 20 x.
      6. Возьмите катетер из раствора ацетона и пусть формованные трубки сушат при комнатной температуре в течение 5 мин.
      7. Осторожно вынуть трубки катетера на желатин, используя зажим и тщательно передачи трубки желатин в стакан пипетку Pasteur с осадкой 2,5% (w/v) решение PCL/DCM.
      8. Пусть, Пастер пипетки, содержащий желатин трубки и PCL/DCM раствор сухой ночлег, под капотом при комнатной температуре.

2. морфология желатин трубки

1. Смонтируйте кусок сушеные желатин трубки на заготовка углерода.
2. Поместить образец в машину coater ионного распыления (см. Таблицу материалы) и пальто образца с золотом для 60 s; Затем, наблюдать его морфологии, растровая электронная микроскопия (см. Таблицу материалы).

3. Культура жировых стволовых клеток человека

1. Поместите жировой ткани (полученные от устных жировой ткани, Клиническая хирургия) в чашку Петри, содержащие 10 мл раствора передачи, состоящий из 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS), пенициллин/стрептомицина 1% и 0,1% раствор глюкозы.
2. Тканях мелко нарежьте (менее 1 мм²) с лезвием скальпеля.
3. Передача тканей в 15 мл пластиковых труб и центрифуги на 500 x g за 5 мин.
4. Удалить супернатант и инкубировать отложений в пластиковые тубы 10 мл среды Дульбекко изменение орла (DMEM, состоящий из 4 мм L-глютамином, пируват натрия 1 мм и 15 мг/Л фенола красного) с 0.1% коллагеназы при 37 ° C, в атмосфере увлажненный содержащие 95% воздуха и 5% CO₂, за 1 день.
5. Центрифуга пластиковую трубку в 500 x g 5 мин, тщательно удалить супернатант (не прикасайтесь отложения) и затем приостановить осадка осторожно, добавив 10 мл DMEM, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и пусть она стоять за 1 день при 37 ° C , в атмосфере увлажненные, содержащих 95% воздуха и 5% CO₂.
6. Центрифуга пластиковую трубку в 500 x g 5 минут и удалить супернатант тщательно; Затем добавьте 1 mL средних стволовых клеток (состоящие из кератиноцитов сыворотки свободной среды (K-УЛП), 5% от FBS, N-ацетил L-цистеин, аскорбиновая кислота-2-фосфат, стрептомицин, амфотерицин) приостановить отложений, передаче его в колбу культуры T25, содержащий 4 мл Стволовые клетки средних и пусть он стоять в течение 3 дней при 37 ° C, в атмосфере увлажненные, содержащих 95% воздуха и 5% CO₂.
7. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл 0,25% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и проинкубируйте его при 37 ° C, в атмосфере увлажненные, содержащий воздуха 95% и 5% CO₂ для 3.5 мин, чтобы отсоединить клетки из нижней части культуры колбу.
8. Добавьте 1 mL FBS, приостановить смесь и передать его на пробки microcentrifuge.
9. Центрифуга подвеска на g 500 x 3,5 мин, приостановить отложений с 1 мл раствора средних стволовых клеток и передача его в колбу культуры, содержащий 5 мл среды стволовых клеток; затем держите его при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 95% воздуха и 5% CO₂.
10. Поддерживайте субкультуры, изменив средних стволовых клеток каждые 3 дня.

4. Культивирование клеток на трубе желатина

1. Стерилизовать желатин трубки с ультрафиолетовым светом за 2 ч; Затем погрузите его в 75% (v/v) этанола и мыть его 2 x с средних стволовых клеток для удаления остаточных этанола.
2. Соберите жировых стволовых клеток человека (hASCs) от культуры колбу.
   1. Удалите носитель из культуры колбу.
   2. Добавить 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 95% воздуха и 5% CO₂ для 3.5 мин, чтобы отделить hASCs от нижней части культуры колбу.
   3. Добавьте 1 mL FBS, приостановить смесь и передать его на пробки microcentrifuge.
   4. Центрифуга пробки microcentrifuge на 500 x g для 3,5 мин; затем удалить супернатант тщательно и приостановить отложений с 1 мл раствора средних стволовых клеток.
3. Трубка желатин в 6-ну пластины, содержащие 3 мл средних стволовых клеток и семян 4 х 10⁴ hASCs на трубу; Инкубируйте их в течение 2 недель при 37 ° C, в атмосфере увлажненные, содержащих 95% воздуха и 5% CO₂.
4. Измените средних стволовых клеток каждые 3 дня, чтобы обеспечить достаточное питание для роста клеток.

5. Immunocytochemistry

1. Удалите средство стволовых клеток и мыть хорошо с PBS.
2. Закрепите трубку с клетки Муравьиная кислота 0,1% для 30 мин при комнатной температуре.
3. Мыть хорошо 2 x с PBS.
4. Добавление сурфактанта (NP-40, 0,05%) и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
5. Мыть хорошо 3 x с PBS.
6. Добавить 2% нормальной козьего сыворотки и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
7. Декант решение, добавить Нестин основное антитело (нейронных прогениторных клеток маркер) и инкубировать на ночь при 4 ° C.
8. Мыть хорошо 3 x с PBS.
9. Добавление вторичного антитела осла mouse-флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и сохранить образец в темноте за 2 ч.
10. Мыть хорошо 3 x с PBS.
11. Добавьте 1 mL Hoechst 33342 пятно ядер и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
12. Мыть хорошо мягко и наблюдать под флуоресцентным микроскопом.

6. в Vivo биосовместимость тест

Примечание: Крысы с весом между 201-225 g были успешно протестированы с использованием этого протокола.

1. Анестезия
   1. Стимулировать и поддерживать анестезии; предпочтительно, анестезировать крыса (8-недельных Sprague-Dawley крыса, самка) через внутримышечной инъекции tiletamine и zolazepam (25 мг / кг + 25 мг / кг, соответственно) и ксилазина (5 мг/кг). Выполните тест стимуляции боль, нажав крыса пальцев для подтверждения анестезии.
2. Стерилизации Хирургическое сайта
   1. Бритья и очистки кожи крыс трапециевидной площади (над задней части шеи) и протереть лосьоном повидон йод подготовить асептических состояние кожи (100 мг/мл).
   2. Обложка Крыса с стерильные хирургические шторы для снижения бактериального передачи и последующего загрязнения хирургической сайта.
3. Имплантация желатин трубки
   1. Аккуратно вырежьте кожу Раца трапециевидной площади с хирургические ножницы.
   2. Создайте рану 2 см и разместите желатин трубки непосредственно на слое между фасции и мышц.
4. Postimplantation хирургия
   1. Закрыть рану с швом нейлона и протрите его повидон йод раствор (100 мг/мл).
   2. Вызвать крыс через внутримышечной инъекции кетопрофена (2,5 мг/кг) и содержит цефазолина (15 мг/кг).
   3. Держите крыса в асептических условиях для 7 дней.
5. Эвтаназия
   1. Крыса умерщвлены через удушение CO₂ в соответствии с принципами AVMA для эвтаназии. Подтвердите смерть крыса, ноги и хвост пинча, следуют груди трогательно обеспечить сердцебиение.
   2. Аккуратно вырежьте Крыса с лезвием скальпеля, удалить имплантированные ткани и принимать фотографии для наблюдения.

Результаты

В этом исследовании мы успешно разработали желатин в волокна (рисA) и трубки (рис. 2B, C) через удобный мокрого прядения концепции. Эти материалы на основе желатина могут быть использованы как любой инструмент медицински?...

Обсуждение

Мы представили разработки на основе желатина биоматериалов с помощью простой влажной спиннинг техники, которые могут применяться в изучении природных полимеров для регенерации тканей. Эта работа продемонстрировала возможность изготовление желатина как источник большой белок без до...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-