תהליך לכייר רטוב-ספינינג מבוססי ג'לטין על התחדשות רקמות

Summary

אנחנו שפותחה. ומתארות פרוטוקול מבוסס על הרעיון ספינינג רטוב, לבנייה של מבוססי ג'לטין biomaterials בשימוש של יישום הנדסת רקמות.

Abstract

מאמר זה מציג שיטה זולה כדי לבדות ג'לטין, כמו פולימר טבעי, לתוך סיבי monofilament או צורות אחרות המתאימות. דרך ספינינג בשיטה רטובה, ג'לטין סיבים המיוצרים על ידי ההבלטה חלקה במדיום קרישה מתאים. כדי להגדיל את השטח פונקציונלי של סיבים אלה ג'לטין והיכולת שלהם לחקות את התכונות של רקמות, ג'לטין שאפשר לעצב לטופס צינור בהתייחסות לרעיון הזה. נבדק על ידי בדיקות במבחנה ויוו, הצינורות ג'לטין מדגימים פוטנציאל גדול עבור יישום בהנדסת רקמות. מתנהג כחומר מילוי מתאים הפער, ג'לטין צינורות יכול לשמש כתחליף הרקמה באזור הפגוע (למשל, במערכת העצבים או לב וכלי דם), כמו גם לקדם התחדשות על-ידי מתן תחליף ישירה של תאי גזע, המעגלים העצביים. פרוטוקול זה מספק הליך מפורט ליצירת biomaterial מבוסס פולימר טבעי, וצפויה יישומה באופן משמעותי לטובת פיתוח correlative פולימרים טבעיים, המסייעים לממש אסטרטגיות התחדשות רקמות.

Introduction

הפיתוח האחרון התחדשות רקמות כוללת את היישום של הנדסת רקמות, אשר מייצג את אתגר עבור השיפור של אסטרטגיות טיפוליות חדשות בטיפולים רפואיים. לדוגמה, הפוטנציאל מוגבל של מערכת העצבים התחדשות, הבאים מפציעה או מחלה, מהווה בעיה בריאותית משמעותית ברחבי העולם. בשל המורכבות של התהליכים הקשורים pathophysiological עם מערכת העצבים, השימוש בשתל מסורתי או היישום של ייצוב ניתוח הוכח להציע הטבות בתוצאות פונקציונלי, אבל אין שום ראיה חזקה עבור ההשפעות של קיבוע עמוד שדרה ניתוח^1,2. ברקמות האזור הפגוע איבד והוחלף האסטרוציטים המושרה hypertrophically³, בסופו של דבר ויוצרים הצלקת גליה צפופה^4,5. מטריצה זו משמש כמחסום כי רחובות ההתאוששות של העצב לתפקד^6,7 , לכן, במידה רבה מעכבת התחדשות. לכן, חומר מילוי מתאים הפער צפוי למנוע האובדן של רקמת ולהפחית את היווצרות של רקמת צלקת-הקשורים על ידי שמירה על השלמות של האזור הפגוע, כמו גם על-ידי מתן החלפה ישירה של תאים עצביים, המעגלים כדי לקדם התחדשות האקסון.

Biomaterials פולימריים היה מועדף כמו פיגומים לתרפיה התחדשות רקמות, בהתבסס על התקנון של התקדמות ההתנהגות ואת הרקמה תא או האקסון וכלה בתמיכה מטריצה חוץ-תאית טבעיים (ECM). התבנית סיבים נחשבת בדרך כלל אבן בניין לחומרים שונים, בשל מבנה חד-ממדי⁸. הסיבים יכול להיות מושגת בדרך כלל על-ידי ההבלטה להמיס או רטוב ספינינג שיטה; עם זאת, גודל גדול והעלות של הציוד וכל הקושי לבצע בשיטות אלה הם מאתגרים. בנוסף, רוב העבודה הקשורים סיבי פולימר התמקדו חומרים סינתטיים או ללא הפרדות צבע. פולימרים טבעיים כמקור biomaterial מציעים מאפיינים הביו טוב יותר עבור גוף האדם. בכל זאת, כדי להשיג את היישור של סיבי פולימר טבעי הוא יחסית קשה יותר של פולימר סינתטי מקורות⁹. ומכאן, ההמרה של פולימר טבעי כמו מקור עשיר לחלבון לתוך סיבי biomaterial הוא לאסטרטגיה חשובה – לא רק הסיבים biomaterial יכול להיות ישירות מבודד מן חומר הגלם, וכך להימנע של טרנספורמציה מיותרים כדי מונומרים, אבל סיבי חלבון יש גם מראה טוב של מאפיינים חיוביים¹⁰.

בהקשר זה, אנו מתארים שיטה זולה עיבוד עבור ייצור סיבי פולימר טבעי דרך התפיסה הבסיסית של ספינינג רטוב, זה יכול להיות מיושם על המשקל מעבדה עבור הנדסת רקמות. ספינינג רטוב מבוצעת על ידי ההבלטה קרישה של פתרון פולימרי לתוך nonsolvent פולימר מתאימים. פתרון מתאים, צמיגה מסטול לתוך בינוני קרישת הדם גורמת מולקולות הפולימר להתמוסס. שלב המעבר, חוטים לאבד את המסיסות שלהם ואז הם זירז בצורה של שלב¹¹פולימר מוצק. בהתייחס לתפיסה זו, אנו מורחב ואז ההתפתחות של הג'לטין לתוך הטופס שפופרת של תהליך היציקה, אשר נחשב ראוי ליישום התחדשות רקמות. בנוסף, ביסודה, אנו גם לפתח כל צורה של חומר מסיבי ג'לטין (למשל, צינור ג'לטין מסתכמת מסיבי ג'לטין מספר), לשני היישומים הרצויים.

ג'לטין, פולימר טבעי מתכלה, נוצר מ קולגן שפגע בסימני, הידרוליזה, כולל כל מדינה הסליל semicrystalline, אמורפי או משולשת של קולגן¹². ידוע הזה קולגן הוא החלבון מבניים חיוני של כל רקמות החיבור של חולייתנים, חסרי חוליות^13,14, אשר דומה למבנה חלבון של ECM העיקרי שגורם עצב צמיחה, במקביל, מחליף את כמות גדולה של גליקוזאמינוגליקן מופרש במהלך פגיעות בעמוד השדרה. לכן, השימוש של ג'לטין כמקור יהיה בחירה מצוינת עבור כל רכב רפואי. מלבד היותו מקור זול, ג'לטין הוא גם מתכלה, cytocompatible ומוכח קלינית להיות זמני פגם מילוי¹⁵. התפתחה צורת צינור, בדיקות במבחנה ויוו המתוארים כאן מדגימים כי ג'לטין יש הביו מעולה התאמתם רקמות בעתיד יישומי הנדסה. בתרבית עם תאי גזע אנושי אדיפוז, ג'לטין צינורות לשפר תאית התמיינות לתוך ובתאים עצביים באמצעות צביעת nestin חיובי כסמן תאי העצבים. יתר על כן, ג'לטין מספקות הפער חומר, המיוצר על ידי השיטה נוסדה במחקר זה, כמו צפוי להיות לניהול ובטוחה וכדי נהנים מאוד רקמות מהנדסים לפיתוח correlative פולימרים טבעיים עבור השיפור של רקמות אסטרטגיות התחדשות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

רקמות השומן התקבלו ניתוחים אורתופדיים כמו המאושר על ידי המוסדיים סקירה הלוח של Tri-שירות כללי החולים, טייפה, טייוואן, R.O.C. הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה-National מרכז רפואי ההגנה, טייוואן (R.O.C).

1. להרטיב ספינינג תהליך

1. פתרון הכנה
   1. להמיס 5 גר' אבקת ג'לטין ב- 100 מ של מים מזוקק פעמיים כדי לקבל 5% (w/v) פתרון ריכוז.
   2. מערבבים את התערובת לאט ב 60-70 ° C בלילה כדי להשיג פיזור הומוגנית לחלוטין ללא בועות.
2. רטוב ספינינג
   1. מערך סיבים
      הערה: תיאור סכמטי של השיטה מוצג איור 1א'. הגדרת ספינינג מצויד עם מכונת משאבת סחרור (ראה טבלה של חומרים) זה מספק מהירות דיוק גבוהה ושולטת מסירה חלקה של הזרם.
      1. מתחברים מזרק 26 G x 1/2 אינץ ' (0.45 מ מ x 12 מ"מ) כמו מזרק פתרון ברור ויניל אבובים.
      2. הכן 100 מ של 99.5% פתרון אצטון בכוס הספל כדי לשמש את האמבטיה קרישת הדם.
      3. להפעיל את המכונה משאבת סחרור 21 סל"ד (3.25 mL/min) ולתת לעמוד למשך מספר שניות בפתרון אצטון לפני גלגול זה הפתרון ג'לטין.
      4. להוציא את הסיבים ג'לטין מהפתרון אצטון, לטבול אותם לתוך 2.5% (w/v) של polycaprolactone/דיכלורומתאן (PCL/DCM) פתרון עם 1:20 (w/w).
      5. תן הג'לטין סיבי בפתרון PCL/DCM יבש למשך הלילה, מתחת למכסה המנוע בטמפרטורת החדר.
   2. היווצרות שפופרת
      הערה: תיאור סכמטי של השיטה מוצג באיור 1ב'.
      1. להשתמש קטטר ורידי היקפיים של 24 G x 3/4 אינץ ' (0.7 מ"מ x 19 מ"מ) שפופרת עובש.
      2. לטעון את הצנתר בתוך תמיסת ג'לטין והחזק אותו שם למשך 3 s.
      3. לטעון את הצנתר בתוך תמיסת אצטון והחזק למשך 1 דקות.
      4. לטעון את הצנתר שוב לתוך הפתרון ג'לטין והחזק אותו שם למשך 3 s.
      5. חזור על x 20 זה הליך חלופי.
      6. להוציא את הקטטר מהפתרון אצטון ולתת את הצינור עי יבש בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      7. בעדינות להוציא ברכבת התחתית ג'לטין הצנתר על-ידי שימוש עוצר דימום ולהעביר בזהירות את הצינור הג'לטין לתוך כוס פיפטה פסטר עם טבילת 2.5% (w/v) של הפתרון PCL/DCM.
      8. תן את פסטר פיפטה שמכילה שהג'לטין שפופרת ואת PCL/DCM פתרון יבש לילה, מתחת למכסה המנוע בטמפרטורת החדר.

2. מורפולוגיה של הצינור ג'לטין

1. לטעון את חתיכת צינור ג'לטין מיובשים על גדם פחמן.
2. שים המדגם לתוך המכונה coater לרעוד. להוציא יון (ראה טבלה של חומרים) המעיל המדגם בזהב 60 s; לאחר מכן, להתבונן מורפולוגיה שלה על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (ראה טבלה של חומרים).

3. תרבות של תאי גזע אנושי אדיפוז

1. מקם את רקמות השומן (המתקבל אוראלי רקמת שומן על ידי ניתוח הקליני) לתוך צלחת פטרי המכילות 10 מ"ל של העברת פתרון המורכב 0.1 M באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.1% גלוקוז.
2. חתוך את הרקמות לחתיכות קטנות (פחות מ- 1 מ מ²) עם להב סכין.
3. העברת הרקמות לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות.
4. הסר את תגובת שיקוע, דגירה שהגופה צינור פלסטיק המכיל 10 מ"ל הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM, בהיקף של 4 מ מגלוטמין פירובט נתרן 1 מ מ, 15 מ ג/ליטר פנול אדום) עם 0.1% collagenase ב 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO₂, עבור יום אחד.
5. Centrifuge צינור פלסטיק ב x 500 g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע בקפידה (אל תיגע המשקע), להשעות את המשקע בעדינות על-ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ואז ומשהים 1 יום ב 37 ° C , באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO₂.
6. Centrifuge צינור פלסטיק ב x 500 g למשך 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה; לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של תאי גזע בינוני (המורכב של תקין ללא סרום בינוני (K-SFM), 5% FBS N-acetyl-L-ציסטאין, חומצה אסקורבית-2-פוספט, סטרפטומיצין, שהוא גוסס) להשעות את המשקע, להעביר אותו לתוך בקבוקון תרבות T25 המכיל 4 מיליליטר גזע בינוני תא, ומשהים 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO₂.
7. למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל אוויר 95% ו- 5% CO₂ 3.5 דקות, כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוק תרבות.
8. להוסיף 1 מ"ל של FBS, להשהות את התערובת, להעביר אותו צינור microcentrifuge.
9. Centrifuge את המתלים ב 500 x g למשך 3.5 דקות להשעות את המשקע עם 1 מ"ל של תאי גזע בינוני, להעביר אותו הבקבוקון תרבות המכיל 5 מ של תאי גזע בינוני; לאחר מכן, לשמור את זה 37 ° C באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO₂.
10. לשמר את תת-תרבות על-ידי שינוי המדיום תאי גזע כל 3 ימים.

4. טיפוח של תאים על המרקע ג'לטין

1. לעקר את הצינור ג'לטין עם אור UV עבור 2 h; . ואז, לטבול אותו ב- 75% (v/v) אתנול, לשטוף אותה 2 x עם תאי גזע בינוני להסיר האתנול שיורית.
2. לאסוף תאי גזע אדיפוז אנושי (hASCs) הבקבוקון תרבות.
   1. הסר בינוני את הבקבוק תרבות.
   2. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO₂ 3.5 דקות, כדי לנתק hASCs מתחתית הבקבוק תרבות.
   3. להוסיף 1 מ"ל של FBS, להשהות את התערובת, להעביר אותו צינור microcentrifuge.
   4. Centrifuge את הצינור microcentrifuge ב x 500 g למשך 3.5 דקות; לאחר מכן, למחוק את תגובת שיקוע בקפידה, להשעות את המשקע עם 1 מ"ל של תאי גזע בינוני.
3. למקם את הצינור הג'לטין לתוך צלחת 6-ובכן המכיל 3 מ"ל של תאי גזע בינוני, זרע 4 x 10⁴ של hASCs אל הצינור; דגירה אותם 2 שבועות ב 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO₂.
4. לשנות המדיום תאי גזע כל 3 ימים כדי לספק מספיק תזונה צמיחת תאים.

5. Immunocytochemistry

1. הסר את תאי גזע בינוני ולשטוף היטב עם PBS.
2. לתקן את הצינור עם תאים עם 0.1% חומצה אצטית סינתטית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את x 2 טוב עם PBS.
4. הוספה של חומרים פעילי שטח (NP-40, 0.05%) תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את x 3 טוב עם PBS.
6. להוסיף 2% עז נורמלית בסרום, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
7. Decant הפתרון הוספת נוגדן ראשוני nestin (סמן תא עצבי קדמון), דגירה בין לילה ב 4 º C.
8. לשטוף את x 3 טוב עם PBS.
9. הוספת נוגדנים משניים חמור אנטי-mouse-fluorescein isothiocyanate (FITC) ולשמור את הדגימה בחושך כבר שעתיים.
10. לשטוף את x 3 טוב עם PBS.
11. להוסיף 1 מ"ל של Hoechst 33342 כתם הגרעינים, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
12. לשטוף היטב בעדינות, התבוננו בו תחת מיקרוסקופ זריחה.

6. בבדיקת התאימות Vivo

הערה: חולדות עם משקל בין 201-225 גרם נבדקו בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה.

1. הרדמה
   1. זירוז ולשמור על הרדמה; רצוי, עזים ומתנגד של עכברוש (בן שבוע 8 ספראג Dawley חולדה, נקבה) באמצעות זריקה תוך שרירית של tiletamine ו- zolazepam (25 מ ג / ק ג + 25 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג). לבצע מבחן גירוי לכאב בהקשת האצבעות של החולדה כדי לאשר את ההרדמה.
2. עיקור וסירוס של האתר כירורגית
   1. לגלח לנקות את העור של שטח הטרפז של עכברוש (על גבו של הצוואר), לנגב את זה עם povidone-היוד להכין את התנאי אספטי של העור (100 מ"ג/מ"ל).
   2. מכסים את העכברוש עם וילונות כירורגי סטרילי כדי לצמצם העברת חיידקים וזיהום עוקבות של האתר כירורגית.
3. השרשה של הצינור ג'לטין
   1. חותכים בעדינות את העור של עכבר שטח הטרפז עם מספריים כירורגיים.
   2. ליצור פצע של 2 ס מ ומניחים את הצינור ג'לטין ישירות על השכבה בין fascia השריר.
4. ניתוח postimplantation
   1. לסגור את הפצע עם תפר ניילון, לנגב את זה עם povidone יוד פתרון (100 מ"ג/מ"ל).
   2. זירוז העכברוש באמצעות זריקה תוך שרירית של ketoprofen (2.5 מ"ג/ק"ג), צפאזולין (15 מ"ג/ק"ג).
   3. שמור את החולדה בתנאים aseptic במשך 7 ימים.
5. המתת חסד
   1. עכברוש הוא מורדמים באמצעות חנק₂ CO לפי הנחיות AVMA המתת חסד. לאשר את מותו של עכבר על ידי צביטה הבוהן וזנב, ואחריו החזה לגעת כדי להבטיח את פעימות הלב.
   2. לחתוך את החולדה בעדינות עם סכין אזמל, להסיר את הרקמה מושתל, לצלם תמונות להשגחה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר זה, פיתחנו בהצלחה את הג'לטין לתוך סיבי (איור 2א) ואת צינורות (איור 2ב, ג) דרך מושג ספינינג רטוב ידידותי למשתמש. חומרים אלה מבוססי ג'לטין יכול להיות מנוצל כמו כל כלי רפואי, בהתאם הצורה שלהם. בהתחשב בכך כי השטח פונקציונלי ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הצגנו את התפתחות biomaterials מבוססי ג'לטין על-ידי שימוש פשוט רטוב ספינינג טכניקה שניתן להחיל במחקר של פולימרים טבעיים עבור התחדשות רקמות. עבודה זו הפגין את האפשרות של ייצור ג'לטין כמקור חלבון נהדר ללא התוספת של מקורות אחרים, במטרה לייעל את המאפיינים של ג'לטין עצמה. התפתחות biomaterials מבוססי ג'לטין ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-