Processo di stampaggio basati su bagnato-filatura di gelatina per la rigenerazione tissutale

Riepilogo

Abbiamo sviluppato e descrivere un protocollo basato sul concetto di filatura bagnata, per la realizzazione di biomateriali basati su gelatina utilizzata per l'applicazione dell'ingegneria tissutale.

Abstract

Questo articolo presenta un metodo economico per fabbricare gelatina, come un polimero naturale, in fibre monofilamento o altre forme appropriate. Attraverso sul bagnato metodo di filatura, fibre di gelatina sono prodotte per estrusione liscia in un mezzo adatto coagulazione. Per aumentare la superficie funzionale di queste fibre di gelatina e la loro capacità di imitare le caratteristiche dei tessuti, la gelatina può essere modellato in una forma di tubo facendo riferimento a questo concetto. Esaminato dai test in vitro e in vivo, i tubi di gelatina dimostrano un grande potenziale per l'applicazione nell'ingegneria tissutale. Agendo come un materiale di riempimento adatto gap, gelatina tubi possono essere utilizzati per sostituire il tessuto nella zona danneggiata (ad esempio, nel sistema nervoso o cardiovascolare), nonché per promuovere la rigenerazione fornendo una sostituzione diretta delle cellule staminali e circuiti neurali. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per la creazione di un biomateriale basato su un polimero naturale, e la sua attuazione è previsto per lo sviluppo del correlativi polimeri naturali, che aiutano a realizzare strategie di rivitalizzazione del tessuto di grande beneficio.

Introduzione

L'ultimo sviluppo nella rigenerazione del tessuto comporta l'applicazione dell'ingegneria tissutale, che rappresenta una sfida per il miglioramento di nuove strategie terapeutiche nei trattamenti medici. Ad esempio, il limitato potenziale di rigenerazione del sistema nervoso, seguenti lesioni o malattia, pone un problema significativo per la salute in tutto il mondo. A causa della complessità dei processi fisiopatologici associati con il sistema nervoso, l'uso di autoinnesto tradizionale o l'esecuzione di chirurgia di stabilizzazione ha dimostrato di offrire benefici in esiti funzionali, ma non ci è prova forte per gli effetti della fissazione spinale Chirurgia^1,2. Il tessuto presso l'area danneggiata è perso e sostituito con hypertrophically indotto astrociti³, alla fine formano un denso cicatrice gliale^4,5. Questa matrice agisce come una barriera che blocchi il recupero del nervo funzione^6,7 ed è, quindi, ostacola notevolmente rigenerazione. Pertanto, si prevede un materiale di divario di riempimento adatto per prevenire la perdita di tessuto e ridurre la formazione di cicatrice-collegato del tessuto connettivo, mantenendo l'integrità della zona danneggiata, nonché offrendo la sostituzione diretta delle cellule neurali e circuiti per promuovere la rigenerazione dell'assone.

Biomateriali polimerici sono state preferite come scaffold per la terapia di rigenerazione del tessuto, sulla base del regolamento della cella o dell'assone comportamento e tessuto progressione attraverso il sostegno naturale della matrice extracellulare (ECM). Il formato della fibra è comunemente considerato come un blocco di costruzione per vari materiali, a causa della sua struttura unidimensionale⁸. Le fibre si ottengono generalmente dei melt estrusione o wet spinning metodo; Tuttavia, le grandi dimensioni e il costo dell'apparecchiatura e la difficoltà di eseguire questi metodi sono impegnativi. Inoltre, la maggior parte del lavoro relazionato a fibre di polimeri è stata concentrata su materiali sintetici o compositi. Polimeri naturali come fonte di biomateriale offrono migliori proprietà di biocompatibilità per il corpo umano. Tuttavia, per ottenere l'allineamento delle fibre di polimeri naturali è relativamente più difficile che di polimero sintetico fonti⁹. Quindi, la conversione di un polimero naturale come una ricca fonte di proteine in fibre di biomateriale è una strategia importante — non solo possono essere direttamente le fibre di biomateriale isolato dalla materia, evitando così una trasformazione inutile ai monomeri, ma la fibre di proteine hanno anche un bell'aspetto e caratteristiche favorevoli¹⁰.

A questo proposito, descriviamo un metodo di trattamento economico per la produzione di fibre di polimeri naturali attraverso il concetto di base della filatura bagnata, che può essere implementata su scala di laboratorio per l'ingegneria tissutale. Filatura bagnata avviene mediante estrusione e la coagulazione di una soluzione di polimero in un nonsolvent di polimero adatto. Una soluzione appropriata, viscosa drogata nel mezzo di coagulazione provoca le molecole di polimero a dissolversi. Attraverso la transizione di fase, i filamenti quindi perdono la loro solubilità e sono precipitati sotto forma di un polimero solido fase¹¹. Riferendosi a questo concetto, abbiamo quindi ampliato lo sviluppo della gelatina in forma tubo tramite un processo di stampaggio, che è considerato adeguato per l'applicazione di rigenerazione del tessuto. Inoltre, intrinsecamente, possiamo anche sviluppare qualsiasi forma di materiale dalle fibre di gelatina (ad es., condotto di gelatina arrotolato da parecchie fibre di gelatina), per altre applicazioni desiderate.

Gelatina, un polimero naturale biodegradabile, è formata da collagene denaturato ed idrolizzato, compreso qualsiasi stato semicristalline, amorfo o Tripla elicoidale di collagene¹². È ben noto che il collagene è la proteina strutturale essenziale in tutti i tessuti connettivi di vertebrati e invertebrati^13,14, che è simile alla struttura di proteina della ECM principale che induce la crescita del nervo e, contemporaneamente, sostituisce una grande quantità di glicosaminoglicani secernuta durante lesioni del midollo spinale. Pertanto, l'utilizzo della gelatina come fonte sarebbe un'ottima scelta per qualsiasi veicolo di intervento medico. Oltre ad essere una fonte economica, la gelatina è anche biodegradabile e citocompatibili e clinicamente dimostrato di essere un temporaneo difetto filler¹⁵. Sviluppato in una forma di tubo,, test in vitro e in vivo, descritti qui dimostrano che la gelatina ha un'eccellente biocompatibilità e idoneità per future applicazioni di tessuto. Coltivate con cellule staminali adipose umane, tubi di gelatina migliorano differenziamento in cellule progenitrici neurali utilizzando la macchiatura positiva nestina come un indicatore delle cellule neurali. Inoltre, la gelatina come materiale di riempimento gap, come prodotto dal metodo stabilito in questo studio, è previsto di essere gestibile e sicuro e di grande beneficio ingegneri di tessuto che stanno attualmente sviluppando correlativi polimeri naturali per la valorizzazione del tessuto strategie di rivitalizzazione.

Protocollo

I tessuti grassi sono stati ottenuti da interventi chirurgici ortopedici, come certificato da istituzionale Review Board di Tri-Service ospedale generale, Taipei, Taiwan, r.o.c. procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di cura degli animali a livello nazionale Centro medico della difesa, Taiwan (R.O.C).

1. Inumidire il processo di filatura

1. Preparazione della soluzione
   1. Sciogliere 5 g di gelatina in polvere in 100 mL di acqua bidistillata per ottenere la concentrazione della soluzione di 5% (p/v).
   2. Mescolare il composto lentamente a 60-70 ° C durante la notte per ottenere una dispersione completamente omogenea senza eventuali bolle.
2. Bagnato di filatura
   1. Formazione della fibra
      Nota: Un disegno schematico del metodo è illustrato nella Figura 1A. Il programma di installazione di filatura è dotato di una macchina pompa peristaltica (Vedi Tabella materiali) che fornisce velocità di alta precisione e controlla la fluidità di erogazione del flusso.
      1. Collegare una siringa di 26 x 1/2 pollice (0,45 mm x 12 mm) come l'iniettore soluzione tubazione del vinile chiaro.
      2. Preparare 100 mL di soluzione di acetone 99,5% in un vetro di bicchiere da utilizzare come il bagno di coagulazione.
      3. Eseguire la macchina pompa peristaltica a 21 giri (3,25 mL/min) e lasciar riposare per alcuni secondi in soluzione di acetone prima di distribuirlo la soluzione di gelatina.
      4. Estrarre le fibre di gelatina dalla soluzione di acetone e immergerli nel 2,5% (p/v) di diclorometano/policaprolattone (PCL/DCM) con 01:20 (w/w).
      5. Lasciate che la gelatina fibre nella soluzione di PCL/DCM asciutta durante la notte, sotto il cofano a temperatura ambiente.
   2. Formazione del tubo
      Nota: Un disegno schematico del metodo è illustrato nella Figura 1B.
      1. Utilizzare un catetere venoso periferico di 24 x 3/4 di pollice (0,7 mm x 19 mm) come stampo tubo.
      2. Inserire il catetere nella soluzione di gelatina e tenerlo lì per 3 s.
      3. Inserire il catetere nella soluzione di acetone e tenere premuto per 1 min.
      4. Caricare nuovamente il catetere nella soluzione di gelatina e tenerlo lì per 3 s.
      5. Ripetere questa procedura alternativa 20x.
      6. Estrarre il catetere dalla soluzione di acetone e lasciare il tubo sagomato asciugare a temperatura ambiente per 5 min.
      7. Estrarre delicatamente il tubo di gelatina dal catetere utilizzando una pinza emostatica e trasferire con cautela il tubo di gelatina in un bicchiere pipetta Pasteur con l'immersione del 2,5% (p/v) della soluzione PCL/DCM.
      8. Lasciate che la pipetta di Pasteur contenente che il tubo di gelatina e la soluzione PCL/DCM asciutto durante la notte, sotto il cofano a temperatura ambiente.

2. morfologia del tubo gelatina

1. Montare il pezzo di tubo di gelatina secche su un albero mozzo del carbonio.
2. Mettere il campione nella macchina spalmatrice Polverizzi dello ione (Vedi Tabella materiali) e rivestire il campione con l'oro per 60 s; poi, osservare la sua morfologia di microscopia elettronica a scansione (Vedi Tabella materiali).

3. cultura di cellule staminali Adipose umane

1. Inserire i tessuti grassi (ottenuti dal tessuto adiposo orale di clinica chirurgica) in una capsula di Petri contenente 10 mL di soluzione di trasferimento costituita da 0.1 M tampone fosfato salino (PBS), 1% di penicillina/streptomicina e 0,1% di glucosio.
2. Tagliare i tessuti in piccoli pezzi (meno di 1 mm²) con un bisturi.
3. Trasferire i tessuti in un tubo di plastica da 15 mL e centrifugare a 500 g per 5 min.
4. Rimuovere il supernatante e incubare il sedimento in un tubo di plastica contenente 10 mL di terreno dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM, composto da 4 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM e 15 mg/L rosso fenolo) con collagenasi 0,1% a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO₂, per 1 giorni.
5. Centrifugare la provetta in plastica a 500 x g per 5 min, scartare il surnatante con attenzione (non toccare il sedimento) e quindi, sospendere il sedimento delicatamente aggiungendo 10 mL di DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e lasciar riposare per 1 giorno a 37 ° C , in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO₂.
6. Centrifugare la provetta in plastica a 500 x g per 5 min e scartare il surnatante con cura; quindi, aggiungere 1 mL di mezzo di cellule staminali (consistendo del keratinocyte medium senza siero (K-SFM), 5% di FBS, N-acetil-L-cisteina, acido ascorbico-2-fosfato, streptomicina e amfotericina) di sospendere il sedimento, trasferirlo in un matraccio di cultura T25 contenente 4 mL di gambo medio delle cellule e lasciar riposare per 3 giorni a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO₂.
7. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di acido di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente aria 95% e 5% CO₂ per 3,5 min, per staccare le cellule dal fondo del matraccio di cultura.
8. Aggiungere 1 mL di FBS, sospendere la miscela e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga.
9. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 3,5 min, sospendere il sedimento con 1 mL di mezzo di cellule staminali e trasferirlo nel matraccio di cultura contenente 5 mL di mezzo di cellule staminali; quindi, tenere a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO₂.
10. Mantenere la sottocultura modificando il mezzo di cellule staminali ogni 3 giorni.

4. coltivazione delle cellule del tubo di gelatina

1. Sterilizzare il tubo di gelatina con luce UV per 2 h; quindi, immergerla in etanolo di 75% (v/v) e lavarlo 2x con il mezzo di cellule staminali per rimuovere il residuo dell'etanolo.
2. Raccogliere le cellule staminali adipose umane (hASCs) dal matraccio di cultura.
   1. Rimuovere il supporto dal pallone di cultura.
   2. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0.25% e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO₂ per 3,5 min, per staccare hASCs dal fondo del matraccio di cultura.
   3. Aggiungere 1 mL di FBS, sospendere la miscela e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga.
   4. Centrifugare la provetta per microcentrifuga a 500 x g per 3,5 min; quindi, eliminare il supernatante attentamente e sospendere il sedimento con 1 mL di mezzo di cellule staminali.
3. Posizionare il tubo di gelatina in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 mL di terreno di cellule staminali e seme 4 x 10⁴ di hASCs al tubo; li Incubare per 2 settimane a 37 ° C, in atmosfera umidificata contenente 95% aria e 5% CO₂.
4. Cambiare il mezzo di cellule staminali ogni 3 giorni per fornire abbastanza nutrizione per la crescita cellulare.

5. immunocitochimica

1. Rimuovere il supporto di cellule staminali e lavare bene con PBS.
2. Fissare il tubo con le cellule con 0,1% di acido acetico glaciale per 30 min a temperatura ambiente.
3. Lavare il ben 2 volte con PBS.
4. Aggiungere un tensioattivo (0.05% NP-40) ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Lavare il ben 3 volte con PBS.
6. Aggiungere il 2% di siero di capra normale e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
7. Decantare la soluzione, aggiungere anticorpo primario nestina (indicatore delle cellule progenitrici neurali) e incubare per una notte a 4 ° C.
8. Lavare il ben 3 volte con PBS.
9. Aggiungere anticorpo secondario asino anti-mouse-isotiocianato di fluoresceina (FITC) e mantenere il campione al buio per 2 h.
10. Lavare il ben 3 volte con PBS.
11. Aggiungere 1 mL di Hoechst 33342 per macchiare i nuclei ed incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
12. Il pozzo di lavare delicatamente e osservarlo con un microscopio a fluorescenza.

6. in Vivo Test di biocompatibilità

Nota: Ratti con un peso fra 201-225 g sono stati testati con successo utilizzando questo protocollo.

1. Anestesia
   1. Indurre e mantenere l'anestesia; preferibilmente, anestetizzare un rat (ratto Sprague Dawley 8-settimana-vecchio, donna) tramite un'iniezione intramuscolare di tiletamina e zolazepam (25 mg / kg + 25mg / kg, rispettivamente) e xilazina (5 mg/kg). Eseguire una prova di stimolo di dolore premendo le dita del ratto per confermare l'amputate.
2. Sterilizzazione del sito chirurgico
   1. La barba e pulire la pelle della zona trapezio di ratto (sopra la parte posteriore del collo) e pulirlo con lozione povidone-iodio per preparare la condizione asettica della pelle (100 mg/mL).
   2. Coprire il topo con teli chirurgici sterili per ridurre il trasferimento batterico e successiva contaminazione del sito chirurgico.
3. Impianto del tubo gelatina
   1. Tagliare delicatamente la pelle dell'area trapezio di ratto con una forbice chirurgica.
   2. Creare una ferita di 2 cm e inserire il tubo di gelatina direttamente sullo strato tra la fascia e il muscolo.
4. Chirurgia delle
   1. Chiudere la ferita con sutura in nylon e pulirlo con soluzione povidone-iodio (100 mg/mL).
   2. Indurre il ratto tramite un'iniezione intramuscolare di ketoprofene (2,5 mg/kg) e cefazolina (15 mg/kg).
   3. Mantenere il ratto in condizioni asettiche per 7 giorni.
5. Eutanasia
   1. Ratto è eutanasia tramite CO₂ asfissia conformemente agli orientamenti AVMA per eutanasia. Confermare la morte del ratto di pizzico di punta e coda, seguito da petto toccante per garantire il battito cardiaco.
   2. Tagliare il ratto delicatamente con un bisturi, rimuovere il tessuto impiantato e scattare foto per l'osservazione.

Risultati

In questo studio, abbiamo sviluppato con successo la gelatina in fibre (Figura 2A) e tubi (Figura 2B, C) attraverso il concetto di filatura bagnata user-friendly. Questi materiali a base di gelatina possono essere utilizzati come qualsiasi strumento medico, a seconda delle loro forme. Considerando che la superficie funzionale e telaio di tali materiali sono più adatti per la rigenerazione tissut...

Discussione

Abbiamo presentato lo sviluppo di biomateriali a base di gelatina utilizzando un semplice wet spinning tecnica può essere applicata nello studio dei polimeri naturali per la rigenerazione tissutale. Questo lavoro ha dimostrato la possibilità di fabbricazione di gelatina come fonte proteica grande senza l'aggiunta di altre fonti, con l'obiettivo di ottimizzare le proprietà della gelatina stessa. Lo sviluppo di biomateriali a base di gelatina è stato interamente effettuato a temperatura ambiente (22-26 ° C). Una prepa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-