조직 재생에 대 한 젤라틴의 젖은 회전-기반 성형 과정

요약

우리가 개발 하 고 젤라틴 기반 생체 조직 공학의 응용 프로그램에 대 한 사용의 건설에 대 한 젖은 회전 개념에 따라 프로토콜을 설명.

초록

이 문서는 monofilament 섬유 또는 다른 적절 한 형태의 젤라틴, 천연 폴리머로 조작 하는 저렴 한 메서드를 제공 합니다. 회전 방법 젖은 통해 젤라틴 섬유는 적당 한 응고 매체에 부드럽게 밀어 남에 의해 생산 됩니다. 이 젤라틴 섬유 및 직물의 기능을 모방 하는 능력의 기능 표면 증가, 젤라틴이이 개념을 참조 하 여 튜브 형태로 성형 수 있습니다. 생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트 검사, 젤라틴 튜브 조직 공학에서 응용 프로그램에 대 한 좋은 잠재력을 보여 줍니다. 행동으로 적당 한 충전 간격 재, 젤라틴 (예를 들어, 긴장 또는 심장 혈관 시스템에), 손상된 된 영역에 조직을 대체할 뿐 아니라 줄기 세포와 신경 회로의 직접 교체를 제공 하 여 재생을 촉진 하 튜브를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 천연 폴리머에 따라 소재를 만들기 위한 자세한 절차를 제공 합니다 그리고 구현 크게 조직 재생 전략을 실현 하는 데 도움이 상호 천연 고분자의 개발 혜택을 받을 것으로 예상 된다.

서문

조직 재생의 최신 개발 조직 공학, 의료 치료에 새로운 치료 전략의 개선에 대 한 도전을 나타내는 응용 프로그램을 포함 한다. 예를 들어 신 경계 재생, 다음 부상 또는 질병의 제한 가능성 전세계 중요 한 건강 문제가 포즈지 않습니다. 신 경계와 관련 pathophysiological 프로세스의 복잡성 때문에 안정화 수술의 구현 또는 전통적인 autograft 사용 표시 되었습니다 기능 결과에 혜택을 제공 하지만 대 한 강력한 증거가 없다 척추 고정 수술^1,2의 효과. 손상된 된 영역에서 조직 손실 이며 hypertrophically 유도 이다³, 결국 밀도 glial 흉터^4,5형성으로 바뀝니다. 이 매트릭스는 블록 신경의 복구^6,7 을 작동 하 고, 따라서, 크게 방해 재생 방 벽으로 작동 합니다. 따라서, 적당 한 충전 간격 재 조직의 손실을 방지 하 고 신경 세포의 직접 교체를 제공 하 여 뿐만 아니라 손상된 된 영역 무결성을 유지 관리 하 여 흉터에 관련 된 결합 조직 형성을 줄일 것으로 예상 되 고 축 삭 재생을 촉진 하는 회로가

고분자 생체 조직 재생 치료, 자연 세포 외 기질 (ECM) 지원을 통해 셀 또는 축 삭 행동과 조직 진행의 규정에 따라 건설 기계로 선호 되었습니다. 섬유 포맷은 다양 한 재료 때문에 그것의 1 차원 구조⁸대 한 빌딩 블록으로 일반적으로 간주 됩니다. 섬유는 용융 압출 또는 습식 방법; 회전에 의해 일반적으로 얻을 수 있습니다. 그러나, 큰 크기와 비용의 장비와 이러한 방법을 수행 하는 데 어려움은 도전. 또한, 고분자 섬유에 관련 된 일의 대부분은 합성 또는 복합 재료에 집중 되었습니다. 천연 고분자 소재의 원천으로 인간의 신체에 대 한 더 나은 생체 적합성 속성을 제공합니다. 그럼에도 불구 하 고, 자연 고분자 섬유의 맞춤을 상대적으로 더 어렵습니다 보다 합성 폴리머 소스⁹. 따라서, 소재 섬유에 단백질의 풍부한 원천으로 자연적인 중합체의 변환은 중요 한 전략은-뿐만 아니라 소재 섬유 수 직접 따라서, 단위체에는 불필요 한 변환을 피하 원료에서 분리 하지만 단백질 섬유는 또한 좋은 모양 및 유리한 특성¹⁰있다.

이와 관련는 조직 공학에 대 한 실험실 규모에 구현할 수 있는 젖은 회전의 기본 개념을 통해 천연 고분자 섬유의 제조에 대 한 저렴 한 처리 방법에 설명 합니다. 젖은 회전 압출 및 응고 폴리머 솔루션의 적당 한 폴리머 nonsolvent에 의해 수행 됩니다. 응고 중에 첨가 하는 적절 한, 점성 솔루션 폴리머 분자 분해를 하면 됩니다. 위상 전환을 통해는 필 라 멘 트 다음 그들의 용 해도 잃게 되 고 고체 폴리머 단계¹¹의 형태로 침전 된다. 이 개념을 언급 하는, 우리가 다음 확장 튜브 형태로 젤라틴의 개발 성형 프로세스, 조직 재생 응용 프로그램에 대 한 적절 한 간주 됩니다. 또한, 본질적으로, 우리는 또한 개발할 수 있습니다 젤라틴 섬유에서 자료의 어떤 모양 든 지 (예를 들어, 젤라틴 도관 올리고 여러 젤라틴 섬유에서), 다른 응용 프로그램을 원하는.

젤라틴, 생 분해성 천연 폴리머, 변성 및 분해 된 콜라겐, 콜라겐¹²의 모든 semicrystalline, 비정 질, 또는 3 배 나선형 상태를 포함 하 여에서 형성 된다. 그것은 잘 알려져 그 콜라겐은 척추 동물 및 무척 추 동물^13,14, 신경 성장 유도 주요 ECM의 단백질 구조와 비슷한의 모든 결합 조직에 필수적인 구조 단백질, 동시에, glycosaminoglycan 척수 부상 중 분 비의 다량을 대체 합니다. 따라서, 소스로 젤라틴을 사용 하 여 모든 의료 차량에 대 한 좋은 선택 것입니다. 되 고 게다가 저렴 한 소스, 젤라틴은 또한 생 분해성 및 cytocompatible 및 임시 제거 필러¹⁵수를 임상적으로 입증 된. , 튜브 형태로 개발 여기 설명 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트 젤라틴은 우수한 생체 적합성 고 미래의 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 적합성을 보여줍니다. 인간 지방 줄기 세포 배양, 젤라틴 튜브 신경 셀 표식으로 긍정적인 nestin 얼룩을 사용 하 여 신경 조상 세포로 세포 분화를 향상. 또한,이 연구에서 설립 하는 방법에 의해 생산 격차 자료 작성으로 젤라틴 관리 하 고 안전 하 고 크게 혜택을 현재 조직의 향상을 위한 상호 천연 고분자를 개발 하는 조직 엔지니어 예정입니다. 재생 전략입니다.

프로토콜

지방 조직으로는 제도적 검토 보드의 세 배 서비스 종합 병원에 의해 인증 정형 외과 수술에서 가져온, 타이 페이, 대만, R.O.C. 절차 동물 주제와 관련 된 국가에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 국방 의료 센터, 대만 (R.O.C)입니다.

1. 젖은 프로세스 회전

1. 솔루션 준비
   1. 5% (w/v) 솔루션 농도를 이중 증 류 물 100 mL에 젤라틴 가루 5g을 분해.
   2. 어떤 거품 없이 완전히 균질 분산을 달성 하기 위해 하룻밤 60-70 ° C에서 천천히 혼합물을 저 어.
2. 젖은 회전
   1. 섬유 형성
      참고: 방법의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 회전 설정 연동 펌프 기계를 갖춘 하 높은-정밀 속도 제공 하 고 제어 흐름의 매끄러운 납품 ( 재료의 표참조).
      1. 명확한 비닐 튜브에 솔루션 인젝터로 26 G x 1/2 인치 (0.45 m m x 12 m m) 주사기를 연결 합니다.
      2. 100 mL 비 커 유리 응고 목욕으로 사용할 99.5% 아세톤 솔루션의 준비.
      3. 연동 펌프 기계 21 rpm (3.25 mL/min)에서 실행 하 고 젤라틴 솔루션 배포 하기 전에 아세톤 솔루션에 몇 초 동안 서 보자.
      4. 아세톤 솔루션에서 젤라틴 섬유 밖으로가 고 1:20 (w/w) polycaprolactone/dichloromethane (PCL/DCM) 솔루션의 2.5% (w/v)에 그들을 담가.
      5. 섬유 건조 PCL/DCM 솔루션에 하룻밤 실 온에서 후드 젤라틴을 하자.
   2. 관 형성
      참고: 방법의 회로도 그림 1B에 표시 됩니다.
      1. 24 G x 3/4 인치 (0.7 m m x 19 m m)의 말 초 정 맥 카 테 터를 사용 하 여 관 형으로.
      2. 젤라틴 솔루션에 테 로드 누르고 거기 3에 대 한 s.
      3. 아세톤 솔루션으로 카 테 터를 로드 하 고 1 분 동안.
      4. 젤라틴 솔루션으로 카 테 터를 다시 로드 하는 방법 그것을 잡고 거기 3에 대 한 s.
      5. 이 대체 프로시저 20 x를 반복 합니다.
      6. 아세톤 솔루션에서 카 테 터를 꺼내와 성형된 튜브 5 분 동안 실내 온도에 건조 하 게.
      7. 부드럽게는 hemostat를 사용 하 여 카 테 터에서 젤라틴 튜브를 꺼내와 신중 하 게 한잔에 2.5% (w/v)의 침수와 파스퇴르 피펫으로 PCL/DCM 솔루션 젤라틴 튜브를 전송.
      8. 파스퇴르 피 펫 포함 젤라틴 튜브 및 PCL/DCM 솔루션 건조 하룻밤 실 온에서 후드를 하자.

2입니다. 젤라틴 튜브의 형태

1. 탄소 스텁에 말린된 젤라틴 튜브의 조각을 탑재 합니다.
2. 이온 스퍼터 coater 기계에 샘플을 넣어 ( 재료의 표참조)와 60에 대 한 골드 샘플 코트 s; 다음, 전자 현미경 검사 법을 검사 하 여 그 형태를 관찰 ( 재료의 표참조).

3입니다. 인간 지방 줄기 세포의 문화

1. 지방 조직 (임상 수술에 의해 구두 지방 조직에서 얻은) 10 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 1% 페니실린/스, 및 0.1% 포도 당으로 구성 된 전송 솔루션을 포함 하는 배양 접시에 놓습니다.
2. 메스 칼 날 작은 조각 (1 m m²미만)으로 조직을 잘라.
3. 15 mL 플라스틱 튜브를 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기로 조직을 전송 합니다.
4. 제거는 상쾌한 고 37 ° c, 습도 분위기에서 0.1% 콜라와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (4 m L-글루타민 m, 1 mM 나트륨 pyruvate, 및 15 mg/L 페 놀 레드의 구성 된 DMEM) 10 mL를 포함 하는 플라스틱 튜브에 앙금을 품 어 1 일에 대 한 95% 공기와 5% CO₂를 포함 하는.
5. 5 분 동안 500 x g 에 플라스틱 튜브를 원심, 신중 하 게는 상쾌한 삭제 (만지지 마십시오는 앙금), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함 된 DMEM의 10 mL를 추가 하 여 퇴적 물을 부드럽게 중단 하 고 그것은 37 ° C에서 1 일 서 보자 95% 공기와 5% CO₂를 포함 하는 습도 분위기에서.
6. 5 분 동안 500 x g 에 플라스틱 튜브를 원심 및 삭제는 상쾌한 신중 하 게; 다음, 4 mL를 포함 하는 T25 문화 플라스 크에 줄기 세포 매체 (keratinocyte 혈 청 무료 매체 (K-SFM), 5 %FBS, N-아 세 틸-L-시스테인, ascorbic 산-2-인산 염, 스 고 암포의의 구성 된)는 앙금을 중단, 전송의 1 mL를 추가 줄기 세포 매체, 그리고 그것은 포함 된 95% 공기와 5% CO₂습도 분위기에서 37 ° C에서 3 일 동안 서 보자.
7. 삭제는 상쾌한 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL을 추가 하 고 문화 술병의 바닥에서 세포를 분리 하려면 95% 공기와 5% CO₂ 3.5 분,를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.
8. FBS의 1 mL을 추가 하 고 혼합물, 중단 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
9. 500 x g 3.5 분에서 현 탁 액을 원심, 줄기 세포 매체의 1 mL와 앙금을 일시 중단 하 고 줄기 세포 매체;의 5 mL를 포함 하는 문화 플라스 크에 전송 그런 다음 포함 된 95% 공기와 5% CO₂습도 분위기에서 37 ° C에서 그것을 유지.
10. 3 일 마다 줄기 세포 매체를 변경 하 여 subculture를 유지 합니다.

4. 젤라틴 튜브에 세포의 경작

1. 2 h;에 대 한 자외선과 젤라틴 관 소독 그런 다음, 75% (v/v) 에탄올에 몰두 하 고 그것을 씻어 잔여 에탄올을 제거 하려면 줄기 세포 매체와 2 배.
2. 인간 지방 줄기 세포 (hASCs) 문화 플라스 크에서 수집 합니다.
   1. 문화 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
   2. 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c 95% 공기와 5% CO₂ 3.5 분, hASCs 문화 술병의 바닥에서 분리를 포함 하는 습도 분위기에서 품 어.
   3. FBS의 1 mL을 추가 하 고 혼합물, 중단 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
   4. 500 x g 3.5 분;에서 microcentrifuge 관을 원심 그리고는 상쾌한을 신중 하 게, 삭제 줄기 세포 매체의 1 mL와 앙금을 일시 중단 합니다.
3. 줄기 세포 매체의 3 mL를 포함 하는 6-잘 접시에서 젤라틴 튜브를 놓고 4 x 10⁴ ; 튜브에 hASCs의 씨앗 포함 된 95% 공기와 5% CO₂습도 분위기에서 37 ° C에서 2 주 동안 그들을 품 어.
4. 변경 줄기 세포 매체 3 일 마다 세포 성장에 대 한 충분 한 영양을 제공 합니다.

5입니다. Immunocytochemistry

1. 줄기 세포 매체를 제거 하 고 PBS 가진 잘 씻어.
2. 0.1% 아세트산 빙하 실 온에서 30 분으로 셀과 튜브를 수정 합니다.
3. PBS로 세척 잘 2 배입니다.
4. 계면 활성 제 (NP-40, 0.05%)를 추가 그리고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
5. PBS로 세척 잘 3 배입니다.
6. 2% 정상 염소 혈 청을 추가 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
7. 솔루션을 가만히 따르다, 1 차적인 항 체 nestin (신경 조상 세포 마커), 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
8. PBS로 세척 잘 3 배입니다.
9. 이차 항 체 당나귀 안티 mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)를 추가 하 고 샘플 2 h에 대 한 어둠 속에서 계속.
10. PBS로 세척 잘 3 배입니다.
11. Hoechst 33342 핵 얼룩 및 실 온에서 10 분 동안 품 어의 1 mL를 추가 합니다.
12. 잘 씻어 부드럽게 형광 현미경으로 관찰 하 고.

6. Vivo 생체 적합성 테스트에서

참고: 201-225 g 사이의 무게로 쥐 성공적으로 테스트 되었습니다이 프로토콜을 사용 하 여.

1. 마 취
   1. 유도 하 고 유지 하는 마 취; 가급적 이면, anesthetize는 쥐 (8 주 된 Sprague Dawley 쥐, 여성)를 통해 tiletamine와 zolazepam의 근육 내 주사 (25 mg/kg + 25 mg/kg, 각각) 및 xylazine (5 mg/kg). 통증 자극 테스트를 수행 하는 anesthetization를 확인 하는 쥐의 손가락을 눌러.
2. 수술 사이트의 살 균
   1. 면도 및 (이상 목 뒤쪽) 쥐의 trapezius 영역의 피부를 깨끗 하 고 피부 (100mg/mL)의 무 균 상태를 준비 povidone-요오드 로션으로 닦아.
   2. 세균성 전송 및 외과 사이트의 후속 오염 줄이기 위해 불 임 수술 커튼으로 쥐를 커버.
3. 젤라틴 튜브의 주입
   1. 부드럽게 수술가 위를 쥐의 trapezius 영역의 피부를 잘라.
   2. 2cm의 상처를 만들고 근 막 및 근육 사이의 레이어에 직접 젤라틴 튜브를 배치 합니다.
4. Postimplantation 수술
   1. 나일론 봉합 된 상처를 닫고 povidone-요오드 솔루션 (100 mg/mL)와 그것을 닦아.
   2. Ketoprofen (2.5 mg/kg) 및 cefazolin (15 mg/kg)의 근육 주사를 통해 쥐를 유도.
   3. 7 일 동안 무 균 조건 하에서 쥐를 유지.
5. 안락사
   1. 쥐는 안락사에 AVMA 지침에 따라 CO₂ 질 통해 안락사 이다. 발가락과 꼬리 핀치, 뒤에 하트 비트를 위해 가슴을 만져 여 쥐의 죽음을 확인 합니다.
   2. 부드럽게 메스 칼 날 쥐를 잘라, 이식된 조직, 제거 하 고 관찰에 대 한 사진을 찍어.

결과

이 연구에서 우리는 성공적으로 섬유 (그림 2A)에 젤라틴과 사용자 친화적인 젖은 회전 개념을 통해 튜브 (그림 2B, C)을 개발. 이 젤라틴 기반 물자는 그들의 모양에 따라 어떤 의료 도구로 활용할 수 있습니다. 우리 생체 외에서 그리고 vivo에서 테스트를 수행 하 여 젤라틴 튜브의 생체 적합성 시험 기능 ...

토론

우리는 간단한 젖은 조직 재생에 대 한 천연 고분자의 연구에 적용할 수 있는 기술 회전을 사용 하 여 젤라틴 기반 생체 재료의 개발을 제시. 이 작품 자체는 젤라틴의 속성을 최적화 하는 목적으로 다른 소스를 추가 하지 않고 훌륭한 단백질 소스로 젤라틴 제조의 가능성을 보여주었다. 젤라틴-기반 생체 재료의 개발 실 온 (22-26 ° C)에서 완전히 실행 되었다. 정확한 솔루션 농도 유지 하 고 모든 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-